Elektroporation als Methode zur Insertion von funktionalen Membranproteinen in Zellen

Gentransfektion einer Zelle um Fremdproteine herzustellen, ist eine übliche Methode. Im Resultat entsteht eine Zelle, die damit in der Lage sind, neue Funktionen zu erhalten, byw. neue Rollen in einem Gewebekontext einzunehmen. Es gibt zahlreiche Beispiele für diese Forschungrichtung, die durchaus schon seit Dekaden existieren. Die Methode der genetischen Manipulation von Zellen gibt es sowohl in transienter, als auch für stabile, permanenter Proteinherstellung in Zellen. These methods can broadly be described as stable or transient, depending on the fate of the genetic material. Grundsätzlich hängt es davon ab, welche Strategie yur genetischen Manipulation verwendet wird: Integration der kodierenden genetischen Information in das Genom einer Zelle, oder eben die Verwendung von Shuttlesystemen, die Plasmide. Die Regulation der Proteinherstellung in beiden Strategien ist nach wie vor extrem schwierig, was ein bekannter Nachteil in der Gentherapieforschung darstellt. In jedem Fall wird die Synthese eines fremde Gen typischerweise von einem mehr oder weniger starken Promotor kontrolliert, wodurch die biochemischen Resourcen einer Yelle stark strapaziert werden, bzw. Stressregulationsstoffwechselwege aktiviert werden. Resultat dieser Synthesestrategien ist oft eine begrenzte Lebensfähigkeit der proteinherstellenden Zellen bis hin zum Zelltod. Ausserdem ist die Regulation der Verfügbarkeit Funktionalität- Aktivität der einzuschleusenden Proteine in lebende Zellen ein bisher bekanntes und grosses Problem für die Weiterentwicklung therapeutischer Strategien, die auf gentherapie basieren. Eine attraktive Alternative zu der Gentransfektion besteht darin, das gewünschte Membranprotein als fertiges Bauteil in eine Zelle hineinzubringen. Dayu soll im Rahmen dieses Antrages eine Architektur entwickelt werden, die ein funktionell gefaltetes Membraneprotein enthält. Das würde effektiv die Regulationsproblematik der hestellung eines Fremdproteines durch eine Gastzelle umgehen und was noch viel bedeutender erscheint, die Notwendigkeit und Einschränkungen umgehen, wie eine Zelle die Existenz eines Proteins auf kotranslationaler Ebene kontrolliert. Verschiedene physikalische Methoden sind bereits entwickelt worden, um Membranproteine in Zellen hineinzubringen, wie Microinjektion, Osmotic shock und Trypsinisierungsmethoden. Eine für uns in diesem Kontext bekannte und interessante, da sehr präzise Methode stellt die Elektroporation dar. Damit moechten wir intrazelluläre Implantate auf molekularer Ebene herstellen, indem wir solch membranstabilisierten, zellfrei hergestellten Membranproteine in die äussere Membran lebender Zellen hineinfusionieren. Für die Herstellung solcher Protein-Membranassemblies haben wir die zellfreie Synthese über die letzen zwanzig Jahre als Methode erfolgreich entwickelt. Sowohl in Phospholipidarchitekturen, wie vesikeln, als auch in Polymerarchitecturen, die aus amphiphilen Blockkopolymeren aufgebaut sind, koennen, wir in gegenwart von Ribosomen- Chaperonen und den entsprechenden Bausteinen, funktionsfähige Membranproteine herstellen. Damit hoffen wir, eine neue Strategie für die Herstellung von Membanproteinen angestossen zu haben, die es ermoeglicht, mit allen post und ko- translationalen Modifikationen, eine entprechende DNA in das jeweilige Membranprotein zu übersetzen und, im Rahmen dieses Antrages, diese Assemblies in lebende Zellmembranen via Elektroporation einzubetten. Die Methode der Elektroporation setzt eine Zelle einem elektrischen Feld aus für kurze Zeit, was in einer erhoehten Permeabilität der Membran resultiert. Dieses Phänomen soll dazu dienen, die Membran-Proteinassemblies in die Membrane integrieren zu lassen und damit zu intrazellulären Implantaten, sprich funktionsfähigen (Fremd-)Membranproteinen in lebenden Zellen zu führen.

Zellen sind die kleinsten, lebenden Einheiten menschlicher Organe und Gewebe. Sie bilden komplexe Einheiten, die eine Vielzahl von Funktionen erfüllen. Die Hauptakteure in der intra-und interzellulären Kommunikation sind dabei Membranproteine und deshalb gehören Membranproteine auch zu den wichtigsten Zielmolekülen der aktuellen Arzneimittelforschung.Membranproteine sind amphiphile Makromoleküle mit einer subtilen Struktur Funktionsbeziehung, es wäre wünschenswert, könnte man Membranproteine basierend auf dem genetischen Code reparieren. Diesen Ansatz gibt es auch bereits und er wird unter der Überschrift Gentherapie erfolgreich beforscht. Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Diabetes wären unter den Krankheiten, die so neu therapierbar wären.Unser Projekt beschäftigte sich mit einer alternativen Methode zur klassischen Gentherapie: hier wurde versucht, ausserhalb des Patienten das Membranprotein basierend auf seiner kodierenden DNA in einem Zelllysat herzustellen (und dabei gegebenfalls korrigierte DNA information zu verwenden) und über Shuttlesysteme, wie künstliche Zellen, wieder zurückzutransferieren. In diesem Projekt haben wir uns entsprechend der geförderten Ressourcen auf den ersten kritischen Schritt dieser Strategie bezogen: die Etablierung eines Shuttle-Systems für korrigierte Membranproteine eines Patienten. Als Chassis System dieses Shuttles haben wir zellähnliche Materialien verwendet: synthetische Polymere, die die Architektur einer Zellmembrane genau nachbilden und Membranproteine direkt nach ihrer Synthese von den ribosomalen Komplexen aufnehmen können. Diese Polymersomen sind damit als Zellmimetika zu bezeichnen und ihre Membranen können mit den Membranen lebender Zellen verschmelzen. Die genauen Bedingungen haben wir in dem vorliegenden Projekt etablieren und verfeinern können. Eine für uns in diesem Kontext bekannte und interessante, da sehr präzise Methode, stellt die Elektroporation dar. Damit haben wir intrazelluläre Implantate in die äussere Membran lebender Zellen hineinfusionieren wollen. Als Methode einer induzierbaren Verschmelzung zwischen membranproteintragendem Polymersomen und Membranen, wie sie lebenden Zellen entsprechen, haben wir die Elektrofusion gewählt, deren Grundlagen der Elektroporation in dem kooperierenden Labor von Herrn Prof. D. Miklav?i? an der Universität Ljubljana etabliert sind. In der Anwendung der Elektrofusionsmethode war es das Ziel, eine gezielte Verschmelzung von in vitro hergestellten Membranproteinen in Polymersystemen mit Zellmembranen genau zu beobachten und die Randbedingungen zu untersuchen. Im Rahmen dieses Projektes ist es uns zwar erfolgreich gelungen, genau diese kritischen Fusionsparameter von Shuttlesystem und Zellmembran zu beleuchten und damit eine wissenschaftliche Basis für die Entwicklung einer weiteren Strategie im Rahmen der klassischen Gentherapie zu etablieren, eine reproduzierbare Fusion zwischen Polymersomen und Lipid(zell)membranen haben wir mit den zur Verfügung stehenden Ressourcen leider nicht erreichen können. Im Rahmen eines Reviewartikels haben wir die erzielten Erkenntnisse und Randbedingungen unserer Fusion der breiten Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt und sind Dank des Projektes Teil der COST und EBTT Initiative geworden, in deren Rahmen wir wertvolle Integration in Doktoratsschulen (PEF Schule), europäische Sichtbarkeit (COST) und internationale Integration (World Congress of Electroporation) gefunden haben.