Funktionelle Relevanz der metabotrophe Glutamat-Rezeptor 1 (mGlu1) Spleißvarianten

Der metabotropic Glutamat-Rezeptor 1 (mGlu1) ist einer der am besten erforschten mGlu Rezeptoren. Es wurde gezeigt, dass er an vielen neuralen Funktionen beteiligt ist. Diese Funktionen umfassen unter anderen die Regulation der Erregbarkeit der Neurone, und die Verarbeitung und Eliminierung von Synapsen. Vier Varianten von mGlu1 Rezeptoren wurden identifiziert, welche einerseits durch eine allgemeinen N-terminalen extrazellulären Bereich und andererseits durch unterschiedliche Längen des C-Terminus charakterisiert werden. Über die funktionale Bedeutung der unterschiedlichen mGlu1 Rezeptor Isoformen ist wenig bekannt, obwohl Unterschiede in ihrer zellulären Verteilung und ihrer Fähigkeit sich mit G- Proteine zu verbinden schon beschrieben wurden. Die meisten Daten zu mGlu1 Rezeptoren beziehen sich auf die längste Variante (mGlu1a), entgegen der vorwiegenden Verbreitung der sogenannten kurzen Isoformen (mGlu1ß und -1) die in den meisten Gehirnregionen dominieren. Durch die Komplexität des Gehirns konnten bis jetzt die zelluläre Reaktionen die in Neuronen von einzelnen mGlu1 Isoformen ausgelöst worden sind, nicht detailliert erforscht werden. Unser Hauptziel ist es, die funktionelle Bedeutung der mGlu1 Isoformen und ihr interagierende Proteine in Neuronen zu verfolgen, sowie ihr zelluläre und subzelluläre Lokalisation als auch ihre Signalübertragungsweg zu erforschen. Für einige Studien werden wir genetisch veränderte Mäuse, die wir kürzlich generiert haben, wie zB Mäuse, die mGlu1a und mGlu1ß Rezeptoren nur in Purkinje-Zellen expremieren, verwenden. In Zellkulturen wird die Interaktion zwischen mGlu1 Rezeptoren und KCTD12 Proteine mit Hilfe von Western-Immunoblots erforschen. Außerdem werden wir die Gefrierbruchtechnik (SDS-FRL) anwenden, um zu untersuchen, ob kurze mGlu1 Varianten, falls sie unabhängig in anderen Isoformen expremiert werden, zielgerichtet in die Plasmamembran transportiert werden und eine normale subzelluläre Aufteilung in den Neuronen behalten. Wir beabsichtigen auch neue Modelle zu entwickeln, um die Funktion der unterschiedlichen mGlu1 Untereinheiten weiter zu klären. Dazu zählen spezifische Antikörper und eine neue konditionale KO/KI Mauslinie, in der die mGlu1 und mGlu1a Rezeptoren markiert sind und in bestimmten Hirnregionen ausgeschaltet werden können. In den letzten Jahren wurde die Hemmung von mGlu1 Rezeptoren als mögliche neue therapeutische Maßnahme für die Behandlung von Angststörungen und Schizophrenie stark diskutiert. Für die Abschätzung von möglichen Wirkungen und Nebenwirkungen ist ein besseres Verständnis der Funktionen der mGlu1 Isoformen unabdingbar.

Metabotrope Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) modulieren nach ihrer Aktivierung durch den Neurotransmitter Glutamat die synaptische Übertragung über intrazelluläre sekundäre Botenstoffe. Der erste geklonte mGluR, mGluR1, reguliert die motorische Koordination, die synaptische Plastizität und die Elimination von Synapsen. Bei Mäusen, bei denen das Gen für diesen Rezeptor entfernt wurde, und bei Patienten mit Hodgkin-Lymphom, die Autoantikörper gegen die extrazelluläre Domäne von mGluR1 produzieren, wurde eine schwere Ataxie beobachtet. Durch alternatives Splicing des mGluR1s entstehen vier Protein- Varianten, die sich in ihren intrazellulären C-terminalen Domänen unterscheiden. Unser derzeitiges Wissen über mGluR1 beschränkt sich fast ausschließlich auf die lange mGluR1 Isoform, während über die anderen kurzen Varianten wenig bekannt ist. Um die Expression der mGluR1-Variante zu untersuchen, haben wir unter Verwendung einer neuen Gene- Targeting-Technologie Mäuse erzeugt, bei denen der C-Terminus dieser Variante zwei kurze Tags trägt. Mit dieser Strategie konnten wir zeigen, dass mGluR1 entweder nicht translatiert wird oder in Mengen, die im Kleinhirn von Mäusen nicht nachweisbar sind. Daher sind nur die Varianten mGluR1 und mGluR1 in Kleinhirnsynapsen vorhanden und aktiv. Der Transport und die Funktion von mGluR1 scheinen stark von Adapterproteinen beeinflusst zu sein, die an seinen intrazellulären C-Terminus binden. Um die Mechanismen zu untersuchen, die die subzelluläre Lokalisation von mGluR1 an Kleinhirnsynapsen regulieren, haben wir eine zweite transgene Mauslinie mit einer einzelnen Aminosäuremutation erzeugt, die die Bindung zwischen mGluR1 und dem Gerüstprotein Homer unterbricht. Die Unterbrechung dieser Interaktion führte zu keinem offensichtlichen Verhaltensphänotyp, unter anderem zeigten diese Mäuse eine normale motorische Koordination. Obwohl in diesen transgenen Tieren keine signifikant veränderte perisynaptische Verteilung von mGluR1 beobachtetet wurde, hatten sie einen höheren Anteil von Synapsen mit intrasynaptischem mGluR1, was darauf hindeutet, dass lange Homer- Proteine die laterale Mobilität von mGluR1 regulieren. Wir erweiterten unsere ultrastrukturelle Analyse des perisynaptischen mGluR1-Clusterings mit einer hochauflösenden Technik auf andere Mauslinien, in denen nur eine mGluR1-Variante spezifisch in Purkinje-Zellen von mGluR1-Knockout-Mäusen wieder eingeführt wurde. Diese Arbeit zeigte, dass unterschiedliche Splice-Varianten von mGluR1 eine unterschiedliche Ausrichtung in Bezug auf den Rand der postsynaptischen Dichte haben, die ihre Aktivität hinsichtlich der Regulation der synaptischen Aktivität, der synaptischen Elimination und der motorischen Koordination beeinflussen könnte.