Topische Applikation von Proteinen als neue Therapieoption

Das Ziel des Projektes ist ein effizienter und gezielter Transport funktioneller Proteine in die viable Epidermis der Haut mit Hilfe intelligenter Systeme zum Wirkstoff-Transfer. Dieser Ansatz soll eine lokale Substitution von Proteinen ermöglichen, die endogen infolge eines genetischen Defekts nicht oder fehlerhaft produziert werden. Das Vorhaben verfolgt einen neuen potenziellen Therapieansatz für die Behandlung der autosomal rezessiven kongeni- talen Ichthyosen (ARCI) als Beispiel für schwerwiegende genetisch bedingte Hauterkran- kungen. Für diese Erkrankungen ist die Linderung der Symptomatik bislang die einzige Behandlungsoption, bei der jedoch die zugrunde liegende Ursache der Erkrankung nicht adressiert wird. In der ersten Projektphase, die von der DFG gefördert wurde, gelang es den KollaborationspartnerInnen zu zeigen, dass eine topische Applikation von Proteinen und deren intraepidermale Anreicherung mit Hilfe von Microneedles, Polyglycerol (PG)-basierten Nanogelen und Hyaluronsäure (HA)-Hydrogelen möglich ist. Durch gezieltes Ausschalten des Gens für Transglutaminase 1 (TGM1) wurden Krankheitshautmodelle für ARCI in vitro generiert, welche die gestörte Barrierefunktion der Haut darstellen. Durch die Nanogel- vermittelte Applikation von Transglutaminase 1 (TGase-1) konnte die Barrierefunktion in TGase-1-defizienten Krankheitsmodellen erfolgreich rekonstitutiert werden. Auf der Basis dieser Experimente sind wir davon überzeugt, dass lokal substituierte Proteine in der viablen Epidermis wirksam sind und ein genetisch bedingtes Defizit krankheitsassoziierter Gene ausgleichen können. In dem vorliegenden Projekt werden wir uns auf PG-basierte Nanogele konzentrieren, die durch hohe Biokompatibilität, hohe Beladungseffizienz, leichte Modifizierbarkeit sowie Schaltbarkeit gekennzeichnet sind. Wir wollen ausschließlich mit humanbasierter, rekonstru- ierter Haut arbeiten, da diese Modelle zahlreiche Vorteile aufweisen, beispielsweise werden Interspezies-bedingte (patho-)physiologische Unterschiede vermieden, die bei der Arbeit mit Tiermodellen berücksichtigt werden müssen. Zudem wollen wir demonstrieren, dass Haut- modelle geeignete präklinische Testsysteme sind und eine umfassende Testung der Wirk- stoffe in vitro erlauben. Dazu werden wir auch funktionell weniger gut charakterisierte Proteine synthetisieren und neue Nachweisverfahren für deren Aktivitätsbestimmung in kultivierten Zellen und Geweben entwickeln. Neben zellulären Wechselwirkungen sind die zelluläre Lokalisation, die biologische Verfüg- barkeit und der Verbleib der Proteine in der Haut nach topischer Applikation von therapeuti- scher und toxikologischer Relevanz: Findet eine Akkumulation in der Zelle oder eine Um- verteilung im Gewebe statt? Wie genau wirkt sich die Proteinsubstitution auf die Hauthomö- ostase aus? Um diese Fragen zu beantworten, werden wir neben TGase-1 weitere Proteine untersuchen, die am Sphingolipid-Stoffwechsel der Haut beteiligt sind, insbesondere 12R- LOX, eLOX-3 und CerS3. Mutationen in den Genen dieser Enzyme, ALOX12B, ALOXE3 und CERS3, können mit ARCI assoziiert sein und führen zu einer Störung der epidermalen Barrierefunktion und veränderten epidermalen Ceramid-Profilen. Die Untersuchungen erfolgen im Rahmen des Projektes in vitro an (Krankheits-)Hautmodellen, die mit Gen- Expressions- und Lipiduntersuchungen charakterisiert und morphologisch und hinsichtlich der Funktion der epidermalen Barriere analysiert werden.

Autosomal rezessive kongenitale Ichthyosen (ARCI) sind eine Gruppe schwerer genetisch bedingter Hautkrankheiten, die von Geburt an sichtbar sind. ARCI sind charakterisiert durch eine ausgeprägte Schuppung und unterschiedlich schwere Rötungen der Haut am gesamten Körper. Alle Formen sind mit einer Störung der epidermalen Barriere vergesellschaftet, die zu einer Störung des Feuchtigkeits-haushalts der Haut und einer reduzierten Schutzfunktion der Haut gegen äußere Einwirkungen führt. ARCI können durch Mutationen in verschiedenen Genen verursacht werden, unter anderen in dem Gen TGM1, das für Transglutaminase 1 kodiert. Transglutaminase 1 ist ein Enyzm in den äußeren Hautschichten und entscheidend für die Bildung der Hornschicht, die die Barrierefunktion der Haut ausmacht. Therapien für kongenitale Ichthyosen sind bisher unbefriedigend, besonders weil ursächliche Therapien nicht verfügbar sind, obwohl die Rolle der Transglutaminase 1 seit mehr als zehn Jahren bekannt ist. In diesem Projekt wurden Experimente durchgeführt, um Transglutaminase 1 im Labor herzustellen (rekombinante Transglutaminase 1) und diese für eine Proteinersatz-Therapie zu verwenden. Das Enzym soll topisch eingesetzt werden, also an seinem Wirkungsort auf der Haut aufgetragen werden. Auch bei Betroffenen mit kongenitaler Ichthyose ist ein direkter Transfer von aktiven Wirkstoffen durch die Hornschicht der Haut nicht oder nur eingeschränkt möglich, daher wurden neuartige Nanotransporter verwendet, die das Protein verpacken und in die Schichten der Haut mit aktivem Stoffwechsel transportieren. Für die Experimente wurden Labormodelle der Haut entwickelt, die den Phänotyp der kongenitalen Ichthyose nachbilden. Dazu wurden entweder Zellen verwendet, die aus Hautproben von Betroffenen isoliert wurden, oder normale Hautzellen, in denen mit Methoden der Gentechnik das Gen TGM1 gezielt ausgeschaltet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass das zugeführte Protein in den Schichten der Modellhaut präsent und enzymatisch aktiv ist. Die Barrierefunktion, die bei Betroffenen charakteristisch gestört ist, wurde im kultivierten Modell innerhalb von zwei Wochen wiederhergestellt. Dies wurde durch Experimente gezeigt, bei denen nach OECD-Richtlinien die Durchlässigkeit der Haut für verschiedene Substanzen untersucht wurde. Diese war bei Krankheitsmodellen deutlich erhöht und wurde durch wiederholte Behandlung fast auf normales Niveau reduziert. Die Experimente zeigten, dass das externe Enzym seine normale Funktion in den Zellen ausüben konnte. Erste Experimente zur Toxizität zeigten keine nachteiligen Effekte durch Nanotransporter oder das rekombinante Protein. Diese Ergebnisse sind viel versprechend für die Entwicklung einer kausalen Therapie für kongenitale Ichthyosen und in Analogie andere genetisch bedingte Krankheiten der Epidermis. In den nächsten Schritten müssen die Toxizität des Verfahrens und die Dosierung des Proteins eingehender untersucht werden, bevor eine klinische Testung der Behandlung begonnen werden kann.