ERANET_NEURON_ADTest

Das pathologische Charakteristikum der Alzheimerkrankheit (AD) ist die Bildung von Amyloid Plaques in der extrazellulären Matrix (EC) des Gehirns. Es konnte gezeigt werden, daß verschiedene Proteasen kooperativ zusammenarbeiten, um das Steady-State Niveau des Amyloid ß-Peptids (Aß), dem Hauptbestandteil der cerebralen Plaques, zu regulieren. Die Aktivität dieser regulierenden Proteasen hängt andererseits von der Wechselwirkung mit endogenen Hemmstoffen wie dem Proteoglykan "Testican" ab. Die verschiedenen Testikane (testicans 1-3) sind extracellulär arbeitende Multidomänen Proteine, die verschiedene Protease-Inhibitor Module in sich vereinigen, wobei jedes Modul gegen eine andere Protease gerichtet ist. Untersuchungen mit Testikanen haben gezeigt, daß die Bildung seniler Protein Plaques einem fein abgestimmten Wechselspiel bestimmter Proteasen und ihrer "persönlichen" Inhibitoren unterworfen ist, die konzertiert die Raten des Aß-Abbaus, bzw. -Aggregation und so das Fortschreiten der Alzheimer Krankheit determinieren. Um die molekularen Mechanismen der Aß- Homeostase besser zu verstehen, planen wir eine Struktur-Funktionsanalyse der Testikane 1-3. Zudem möchten wir die Komplexe verschiedener Testikane und ihrer Zielproteasen, die mit Alzheimer in Verbindung gebracht werden, untersuchen. Interessanterweise tragen auch andere cerebrale EC Proteoglykane, wie z.B. Neurokan, Versikan und Perlekan, eine Sammlung verschiedener Protease-Inhibitor Module. Diese funktionelle Homologie deutet an, daß die vom Testikan angewandte Inhibitionsstrategie ein Paradigma für die Regulation der Aktivität von EC Proteases darstellen könnte. Von daher würde die Aufklärung dieses Mechanismus` helfen, die sogenannten "Protein Folding Diseases" besser zu verstehen und entsprechende neue medizinische Strategien zu entwickeln.

Alzheimer wird durch fehlgefaltete A? und Tau Proteine verursacht, die im Gehirn als extrazelluläre Amyloid-Plaques oder intrazelluläre Tangles aggregieren. Da dieser Prozess konzentrations-abhängig verläuft, ist die Qualitätskontrolle von löslichen und aggregierten zerebralen Proteinen von fundamentaler Bedeutung für die Ausbildung der Krankheit. So wurde gezeigt, dass aktivierte Astrocyten, die die Amyloid-Plaques umgeben, diesen Prozess maßgeblich kontrollieren, indem sie bestimme Proteasen sekretieren, die A? abbauen. Die Aktivität dieser sekretierten Proteasen wird durch verschiedene Mechanismen genau reguliert. Unter anderem gibt es verschiedene Regulatorproteine, die die Aktivität der Proteasen direkt beeinflussen. Zu diesen Regulatoren zählt das Testikan Protein, ein Protease Inhibitor, der einen wichtigen Einfluss auf den Metabolismus der A?-Proteine und daher auch für die Entstehung von Alzheimer hat. Um das Zusammenspiel von Proteasen und Inhibitoren besser zu verstehen, wollten wir die Struktur und Funktion der Testikane und ihrer Angriffspunkte, den HtrA1 Proteasen, untersuchen. Aufgrund von Problemen, Testikan in rekombinanter Form herzustellen, haben wir uns auf die Charakterisierung der menschlichen HtrA1 Protease und des bakteriellen Gegenstücks DegQ konzentriert. Das HtrA1 Protein ist eine sogenannte PDZ-Protease, die eine wichtige housekeeping Funktion in der extrazellulären Matrix ausübt. Zudem wird die Protease mit verschiedenen Protein-Faltungs Krankheiten wie Alzheimer, Arthritis und age-related macular degeneration in Verbindung gebracht. Leider ist wenig über den Protease Mechanismus von HtrA1 bekannt. Im Rahmen des Eranet Projektes konnten wir die Kristallstruktur von HtrA1 in seiner aktiven und inaktiven Form bestimmen und anschließend eine genaue biochemische Analyse seiner mechanistischen Eigenschaften durchführen. Dabei konnten wir einen neuen Regulationsmechanismus aufklären. HtrA1 wird unmittelbar durch die Bindung seines spezifischen Substrats in den aktiven Zustand überführt. Eine Feinregulation der Protease erfolgt vermutlich durch zusätzliche Protein-Protein Wechselwirkungen, die zum Beispiel eine spezifische Lokalisierung der Protease und/oder eine Modifikation seiner Substrat Spezifität bewirken. Basierend auf den strukturellen Daten, kann nun eine gezielte Mutagenese durchgeführt werden, um weitere Regulatorproteine zu identifizieren und die Funktion von HtrA1 unter normalen und pathologischen Bedingungen aufzuklären.In einem Folgeprojekt untersuchten wir das bakterielle Protein DegQ, das als extracytosolisches Chaperone fungiert. Dabei konzentrierten wir uns auf den Mechanismus, wie DegQ ungefaltete Substratproteine ohne Verwendung chemischer Energie (ATP) in ihren nativen Zustand zurückführt. Überraschenderweise deuten unsere strukturellen und biochemischen Daten darauf hin, dass DegQ dieselben mechanistische Strategien verwendet wie ATP-abhängige, cytosolische Kontrollfaktoren, wie z.B das GroE Chaperonine. Im DegQ System wird die Energie, die benötigt wird, um fehlgefaltete Proteine zurückzufalten, durch eine regulierte Re-Assemblierung des DegQ Oligomers gewonnen. Dabei wandelt sich DegQ aus einer Substratfalle (6-mer) in einen Faltungskäfig (12/24-mer) um. Dieser Mechanismus, der ohne ATP-Verbrauch abläuft, scheint für alle HtrA Proteine und andere Kontrollfaktoren in der extrazellulären Matrix von großer Bedeutung zu sein.