Funktionsanalyse von Chloritdismutasen und verwandten Peroxidasen mit EPR

Die Häm b-hältigen Enzyme Chloritdismutase und die strukturell verwandten Farbstoff- abbauenden Peroxidasen sind Teil einer sog. Protein-Superfamilie. Sie haben hohe strukturelle Ähnlichkeiten und haben sich aus einem gemeinsam Vorfahren durch divergente Evolution entwickelt. Chloritdismutase kann das starke und toxische Oxidationsmittel Chlorit in harmloses Chlorid und ein Sauerstoffmolekül umwandeln. Die verwandten Peroxidasen sind in der Lage, große Moleküle oxidativ abzubauen, z.B. Farbstoffe der Textilindustrie oder Lignin. Interessanterweise haben Chloritdismutasen fast keine Peroxidaseaktivität, während die Peroxidasen durch Chlorit zerstört werden. In diesem Projekt wird nun untersucht, welche strukturellen Elemente im aktiven Zentrum dieser Enzyme für diese großen enzymatischen Unterschiede verantwortlich sind. Dazu werden jeweils zwei Vertreter dieser beiden Proteinfamilien rekombinant in E. coli hergestellt und durch ein breites biochemisches und biophysikalisches Methodenspektrum untersucht werden. Die Schlüsselmethode dabei wird die Elektronenspinresonanz-Spektroskopie sein, die in Kombination mit anderen Methoden und Proteinengineering Informationen über die tatsächliche geometrische und elektronische Struktur im Hämzentrumwährendder verschiedenenSchritte im Enzymturnover liefern wird. Dabei werden Wildtyp-Enzyme und designte Mutanten in ihrer Wechselwirkung mit Substraten, Liganden oder Inhibitoren untersucht werden. Letztendlich kann damit der Reaktionsmechanismus dieser beiden Enzymfamilien aufgeklärt werden. Dadurch wird die wissenschaftliche Voraussetzung geschaffen, dass Chloritdismutasen und die verwandten Peroxidasen in Zukunft technologisch eingesetzt werden können. Typische Anwendungsgebiete wären die Entfernung von Chlorit aus der Umwelt (z.B. Trinkwasser) oder der Abbau von Lignin zu Materialien, die in Brennstoffzellen verwendet werden können.

Hämproteine und Hämenzyme sind in allen Organismen in großer Zahl und Variabilität anzutreffen. Sie katalysieren vielfältige und wichtige Reaktionen in den diversen Stoffwechselwegen. Zudiesen eisenhältigenBiokatalysatoren gehören Sauerstofftransportproteine wie das Hämoglobin, Elektronentransferproteine wie z.B. Cytochrome, Katalasen, Peroxidasen, Monooxygenasen, Biosensoren und viele andere mehr. In den letzten Jahren wurde viele neue bislang unerforschte Hämprotein-Familien entdeckt. Dazu gehören auch die in diesem Projekt untersuchten Chloritdismutasen (Clds) und eine neue Familie von Peroxidasen, die als entfärbende Peroxidasen (dye-decolorizng peroxidases, DyPs) ursprünglich bezeichnet wurden, da sie Farbstoffe oxidieren können. Bakteriele Clds und DyPs haben eine sehr ähnliche dreidimensionale Struktur und auch die Architektur des Hämzentrums zeigt viele Gemeinsamkeiten. Beide Enzymfamilien haben Häm b im aktiven Zentrum, das von Histidin proximal koordiniert wird. Trotz dieser Ähnlichkeiten ist die enzymatische Reaktivität in den beiden Proteinfamilien komplett unterschiedlich. Chloritdismutasen bauen das Umwelt- und Zellgift Chlorit in harmloses Chlorid und Luftsauerstoff ab, während die Peroxidasen mit Hilfe von Wasserstoffperoxid Oxidationsreaktionen katalysieren. In diesem Projekt konnten die katalytisch relevanten Redoxintermediate und distalen Aminosäuren beider Enzymfamilien aufgeklärt werden. Es konnten (i) die sog. Kristallstrukturen dieser Proteine, (ii) die elektronischen Konfigurationen der relevanten Redoxintermediate mit Hilfe der Elektronenspinresonanz-Spektroskopie und schließlich (iii) die Reaktionsmechanismen von Clds und DyPs aufgeklärt werden. Weitere wichtige Informationen über die Stabilität dieser Biokatalysatoren, die pH-Abhängigkeit der Enzymreaktionen und inhibierende Mechanismen bilden nun die Basis für die künftige umweltbiotechnologische Anwendung engineerter Clds, z.B. bei der Reinigung von mit Chlorit verseuchtem Trinkwasser bzw. für die Generierung von Luftsauerstoff aus Chlorit im Labormaßstab. Die Untersuchungen der DyPs zeigte eine sehr hohe katalytische Variabilität innerhalb dieser Enzymfamilie. So zeigen z.B. DyPs aus der Klasse B keine typische Peroxidaseaktivität und könnten eine bislang unbekannte Rolle in der Redoxregulation von Kanälen in der cytoplasmatischen Membran von Bakterien spielen.