EUROMembrane_LIPIDPROD_Detecting rafts in the live cell plasma membrane

Membranes are central to understanding cellular organization and function. About one third of the genome encodes membrane proteins and many other proteins spend part of their lifetime bound to membranes. The major class of membrane proteins are transmembrane proteins, spanning the bilayer. The other class are the peripheral membrane proteins which function by binding to the interfacial regions of the bilayer, either at the exoplasmic or at the cytoplasmic side. The third class of proteins is anchored in the membrane by covalently attached lipid moieties. The lipid bilayer, which constitutes the fluid matrix of the membrane was for years neglected. The lipid matrix itself was considered to be a solvent for membrane proteins. This changed with the increasing awareness of the complexity of the lipid composition of bilayers. Eukaryotic membrane lipids are glycerophospholipids, sphingolipids, and sterols and it is thought that more than 1000 different lipid species are present in mammalian cells. Why there are so many lipids in cell membranes is not understood. Another promoter of bilayer research was the introduction of the raft concept to subcompartmentalize cell membranes. This concept as it stands today implies that cell membranes containing sphingolipids, saturated phosphatidylcholine and cholesterol are occupied by fluctuating nanoscale assembles that are poised for coalescence into larger scale, more stable domains including some and excluding other proteins. In this scheme the biophysical propensity to phase separate is coupled to specific lateral association involving oligomerization, lipid- protein, and protein-protein interactions such that when amplified during raft coalescence specific liquid platforms form that are postulated to be functional in membrane trafficking and signaling. The stage is thus set to bring this research field to the next level of sophistication by coming to grips with how functional raft platforms form in cells. The vision of this CRP is to provide the multidisciplinary support that will be required to analyze how nanoscale protein-lipid assemblies interact to form functional platforms and how membrane proteins associate with lipids to modulate function. Most importantly, we will apply the whole set of technologies to same cell and protein systems as well as in vitro and in silico. In order to clarify the existence and to further characterize their properties, our group recently designed an experimental strategy for in vivo imaging of single membrane rafts by ultra-sensitive fluorescence microscopy, termed "Thinning Out Clusters while Conserving the Stoichiometry of Labeling" (TOCCSL). The methodology is based on advances to detect and characterize individual molecules in the live cell plasma membrane. In contrast to our efforts to track single molecules, we focus here on the brightness as a measure of the local stoichiometry. The overall idea is to detect rafts via their property to recruit specific membrane proteins. In this subproject, we focus on the direct visualization and analysis of lipid rafts in the live cell plasma membrane under various conditions. We will address the resting state of T cell rafts, and investigate the signaling induced formation of larger structures. Particular emphasis will be laid on studying raft heterogeneity: while there is increasing evidence for different types of lipid rafts, the origin still remains unclear. Using a two-color variant of TOCCSL, we will study the degree of colocalization of any two differently labeled membrane constituents in the same membrane rafts. Heterogeneous composition of membrane rafts will be investigated using differently labeled GPI-anchored proteins as markers. Finally, the recruitment of membrane proteins to lipid rafts will be analyzed.

Membranen sind zentral für unser Verständnis von zellulärer Organisation und Funktion. Circa ein Drittel des Genoms kodiert für Membranproteine, und zahlreiche andere Proteine verbringen einen Teil ihrer Lebensdauer in Assoziation mit Membranen. Der Lipidmatrix selbst wurde lange Zeit nur die Funktion eines Lösungsmittels für Membranproteine zugeschrieben. Das änderte sich, als man die außerordentliche Komplexität der Lipid-Zusammensetzung der Zellmembran erkannte. Ein Wegweiser in der Wissenschaft von Lipid-Membranen war die Einführung der Raft-Hypothese zur Beschreibung der Kompartmentalisierung von Membranen. Dieses Konzept basiert auf der Annahme, dass Zellmembranen von fluktuierenden Nano-Domänen durchzogen sind. Es wurde vermutet, dass diese Nano-Domänen zu größeren, stabileren Domänen anwachsen können, welche eine charakteristische Population von Proteinen beinhalten. Das Verbundprojekt hat mit einem multidisziplinären Ansatz versucht, herauszufinden, wie Protein-Lipid Domänen miteinander interagieren, wie sie größere Strukturen aufbauen, und wie Membran-Proteine mit Lipiden assoziieren und dabei ihre Funktion modulieren. In unserem Subprojekt verwendeten wir dazu zwei Zugänge: i) Mittels Einzelmolekülmikrokopie: Wir haben vor einiger Zeit eine Methode entwickelt, die gemeinsame Diffusion von Membranproteinen oder -lipiden basierend auf der Helligkeit der beobachteten Lichtpunkte zu charakterisieren. In diesem Projekt verwendeten wir unsere Methode, die gemeinsame Diffusion von Lipid-verankerten (sogenannten GPI-verankerten) Proteinen in der Plasmamembran lebender Zellen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass ca. die Hälfte aller GPI-verankerten Proteine als Dimere diffundieren. Die Bildung von Dimeren war abhängig vom Cholesteringehalt der Membran und von der Umgebungstemperatur: leicht erhöhte (fieberähnliche) Temperaturen führten zur vollständigen Auflösung der Dimere. Weiters beobachteten wir Effekte durch die Aktivierung eines Enzyms, welches die Lipidzusammensetzung der Membran veränderte. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass Membran-Lipide für die Interaktion von Membranproteinen wichtig sind. ii) Mittels Mikrostrukturierung. Im zweiten Zugang verwendeten wir eine Methode, die wir kürzlich zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Membran-Proteinen entwickelt hatten. Dazu wird ein Partner in einer Mikrostruktur direkt in der Plasmamembran angeordnet, indem die Zellen auf mikrostrukturierten Oberflächen angewachsen werden. Die Interaktion mit dem zweiten Protein wird über dessen Rekrutierung zu den Mikrostrukturen erfasst. In diesem Teilprojekt wollten wir herausfinden, ob die Anreicherung von GPI-verankerten Proteinen eine Auswirkung auf die biophysikalischen Eigenschaften der Lipid Doppelschicht hat. Zu unserer Überraschung fanden wir keine Anreicherung anderer GPI-verankerter Proteine, und keine Änderung des Phasenzustandes der Lipid-Doppelschicht. Wir fanden hingegen Größenausschlusseffekte aufgrund der erhöhten Proteinkonzentration in den Mikrostrukturen.