Interaktion zwischen Kupfer-Metallothionein und Hämocyanin

Metallothioneine (MTs) sind vorwiegend niedermolekulare, Cystein-haltige Proteine mit einer hohen Bindungsaffinität für Übergangs-Metallionen, wie Cu+, Zn2+ und Cd2+. Sie spielen eine wesentliche Rolle im Metallstoffwechsel tierischer Organismen. Die meisten Metallothioneine bilden üblicherweise Mischkomplexe mit unterschiedlichen Metallionen. In terrestrischen Gastropoden (Landschnecken) haben sich dem gegenüber im Verlauf der Evolution Metall-spezifische Metallothionein-Isoformen entwickelt.Eine davon,das Kupfer- Metallothionein (CuMT), bindet ausschließlich Cu+. Diese Isoform wird darüber hinaus nur in einem einzigen Zelltyp exprimiert, der als Rhogocyte bezeichnet wird. Rhogocyten sind Mollusken-spezifische Zellen des Bindegewebes und des Hämocöls, in denen darüber hinaus auch Hämocyanin, der Kupfer- haltige Blutfarbstoff der Mollusken, synthetisiert wird. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe legen nahe, dass das CuMT in diesen Zellen als Donator vonCu+ für das naszierende Hämocyanin fungiert. Diese Hypothese wird von Befunden gestützt, wonach MTs auch eine wesentliche Rolle beim Transfer des Kupfers auf das Hämocyanin von Crustaceen (Krebstieren) zu spielen scheinen, wenngleich der zugrunde liegende Mechanismus nie aufgeklärt wurde. Im vorliegenden Projekt sollen die Arbeitshypothese eines Kupfer-Transfers von CuMT auf Hämocyanin bei zwei Vertretern der heimischen Landschnecken (Helix pomatia und Cantareus aspersus) überprüft und die zugrunde liegenden Mechanismen untersucht werden. Dies soll im Rahmen eines DACH-Projektes unter Leitung und Koordination des Projektwerbers (Dr. Reinhard Dallinger) in Kooperation mit einem deutschen Partner (Dr. Bernhard Lieb) und unter Mitarbeit von Forscherinnen aus Spanien (Dr. Silvia Atrian und Dr. Mercé Capdevila) erfolgen. Die Untersuchungen erfolgen im Rahmen von vier Forschungs-Ansätzen, in denen die zentrale Frage des Kupfer-Transfers von CuMT auf Hämocyanin von unterschiedlichen Standpunkten aus und mit unterschiedlichen Methoden beleuchtet werden soll. Erstens sollen Transkriptom- und Genom-Datenbanken der beiden zu untersuchenden Schneckenarten generiert werden, die mit bioinformatischen Methoden nach möglichen Protein- Kandidaten gescreent werden sollen, die am Kupfertransfer beteiligt sein könnten. Zweitens sollen unter Verwendung stabiler Kupfer-Isotopen Metall-Austausch-Experimente zwischen CuMT und Hämocyanin in vitro und in vivo (durch rekombinante Expression in E. coli) durchgeführt werden. Drittens soll eine direkte Protein-Wechselwirkung zwischen CuMT und Hämocyanin mit Hilfe eines Yeast Two-Hybrid- Ansatzes untersucht werden. Viertens sollen mögliche Wechselwirkungen zwischen CuMT und Hämocyanin in den Rhogocyten der beiden Arten durch bildgebende Verfahren (Elektronenmikroskopie, Laser-Scanning-Mikroskopie, Fluoreszenz- und Lumineszenz-Mikroskopie) visualisiert werden. Wir erwarten uns von den Untersuchungen Aufschluss darüber, wie das Spurenelement Kupfer in den Rhogocyten der Schnecken in das naszierende Hämocyanin gelangt. Allein das ist angesichts unseres geringen Wissensstandes - eine spannendemetall-biochemischeFragestellung.Ein zugegebenermaßen spekulativer Aspekt istdarüberhinaus der mögliche Nachweis einer Metallochaperonin-Funktion für CuMT. Ein derartiger Befund würde, falls zutreffend, unsere Vorstellung über die Rolle der Metallothioneine insgesamt verändern.

Die meisten Gastropoden verwenden für ihre Atmung das Kupfer-haltige Atmungspigment Hämocyanin (Hc), in dem der Sauerstoff über Brückenbindung mit zwei Kupferionen gebunden wird. Bei terrestrischen Heliciden (Land-Lungenschnecken) bildet das Hc große Moleküle mit einem Molekulargewicht von 9 Millionen Dalton und einer Quartärstruktur aus zwei zylindrischen Dekameren, von denen jedes aus zehn kettenförmigen Hämocyanin-Untereinheiten besteht. Diese werden bei vielen Schnecken in Mollusken-spezifischen Zellen synthetisiert, die als Rhogocyten bezeichnet werden und der Metallhomöostase und Stressabwehr dienen. In diesen Zellen wird interessanterweise auch eine Cu-spezifische Metallothionein-Isoform (CuMT) exprimiert, die offenbar für den Kupferstoffwechsel dieser Zellen verantwortlich sind. Es besteht daher die Annahme, dass das Cu(I) dem Hc über Vermittlung des zellspezifischen CuMT zugeführt wird. Im vorliegenden Projekt sollte diese Hypothese anhand der Helicidenart Cornu aspersum überprüft werden. Es stellte sich heraus, dass diese Schneckenart neben dem CuMT drei Hc-Isoformen besitzt: Hc-N, Hc-D und Hc-. Interessanterweise ist die Genstruktur dieser Isoformen äußerst komplex und weist eine Vielzahl an Introns auf, die wahrscheinlich eine wichtige regulatorische Rolle bei der Transkription der Hc-Gene spielen. Das aus der Hämolymphe von Cornu aspersum isolierte Hc-Molekül kann durch Kupferentzug in das Apo-Hc überführt und anschließend durch Cu(I)-Aufnahme wieder rekonstituiert werden. Diese Reaktion kann in vitro mit Hilfe eines Cu(I)-Chelators durchgeführt werden, funktioniert jedoch nicht mit dem nativen CuMT. Jedoch deuten unsere bisherigen Ergebnisse darauf hin, dass das CuMT in der Lage ist, Cu(I) auf die viel kleineren Hc-Untereinheiten zu übertraten. Das würde Sinn machen, da es darauf hindeutet, dass die in den Zellen erfolgende Cu-Übertragung unter physiologischen Bedingungen in vivo schrittweise während der Synthese der Hc-Untereinheiten erfolgt, wodurch auch eine bessere Qualitätskontrolle der Cu-Übertragung möglich wäre. Darüber hinaus hat sich noch herausgestellt, dass die Expression einzelner Hc-Isoformen durch Stressbelastung aufreguliert werden kann, möglicherweise als Anpassung an einen unter Stressbedingungen ansteigenden Sauerstoffbedarf.