EUROCORES EuroMEMBRANE_OXPL-Single molecule tracking of oxidized phospholipids

Oxidized phospholipids (oxPL) are now known to be involved in several major pathological conditions, such as atherosclerosis, inflammation, cancer, type 2 diabetes, and Alzheimer`s disease. However, a coherent overall view of the causalities and mechanisms is lacking, mainly because of insufficient understanding of the cellular as well as molecular mechanisms. The OXPL consortium represents an integrated interdisciplinary approach of European research laboratories already active in this field, together with additional skills brought into the project by groups representing state-of-the-art expertise in method and instrumentation development for the characterization of biomolecules, their interactions and localization in cells. The project will pave the way to the development of improved diagnostics, therapies and preventive measures to combat the above diseases, and will take European research to the leading edge in this emerging and important research field. The OXPL consortium aims at unravelling the molecular level view of the metabolism, roles and mechanisms of action of oxPL in cells, both under physiological conditions and in diseased states. Accordingly, we assembled the leading European research groups active in research on chemical biology, biochemistry, cell biology, biophysics, and molecular pathology of oxPL, as well as lipidomics, mass spectrometry, single molecule measurements, high resolution imaging, fluorescence spectroscopy, NMR, ESR, and computer simulations. Our consortium is strongly interdisciplinary, from medical investigators to theoretical physicists. A major part of this proposal will be devoted to the development of new assays and methodologies, and to novel applications of state-of-the-art technologies. Throughout the project a number of new oxPL analogues need to be synthesized and characterized, to aid monitoring their behaviour in cells and to be able to isolate their adducts with other biomolecules. Because of the dimensions involved, high resolution imaging techniques need to be adapted to visualize these lipids in cells. Of particular concern is that traditional fluorescence microscopy readily generates reactive oxygen species, so approaches to circumvent such issues are mandatory. It is particularly important to introduce these problems to physicists and biophysicists with a track record in the instrumentation and method development. Likewise, an active dialogue with theoretical physicists allows the use of computer simulations for the prediction of properties, which can then be analyzed in model systems as well as cells. In our subproject we will follow the motion of individual fluorescently labeled oxidized phospholipid molecules in the plasma membrane of living cells. Diffusion constants will be determined for different molecular species in different cell lines. In addition, we will address deviations from Brownian motion to understand the various forces acting on the diffusing species at a nanoscopic length scale; in particular, we will characterize in detail sites of immobilization, which were identified in preliminary experiments. For this, we will employ novel variants of ultra- sensitive fluorescence microscopy, based on light sheet excitation and combination with photoactivation microscopy. Finally, modification of plasma membrane structure by the addition of the unlabeled oxPL will be measured by single molecule tracking of trace amounts of the fluorescent probe.

Phospholipide mit mehrfach ungesättigten Fettsäureketten sind anfällig für Modifikationen durch reaktiven Sauerstoff, wodurch eine Vielzahl von biologisch aktiven oxidierten Phospholipiden (oxPL) entstehen kann. oxPL spielen eine wichtige Rolle in vielen Krankheitsbildern wie z.B. Atherosklerose, Entzündungen, Krebs, Typ 2 Diabetes, sowie Alzheimer. Ein kohärentes Bild der zellulären sowie molekularen Wirkmechanismen fehlte jedoch. Daher bildeten wir das OXPL Konsortium, einen interdisziplinären Zusammenschluss Europäischer Forschungsgruppen, welche bereits aktiv in diesem Feld tätig waren; dazu kamen Gruppen mit Schwerpunkt Technologie-Entwicklung. In unserem Subprojekt untersuchten wir mittels hochsensitiver Fluoreszenzmikroskopie das Verhalten von oxPL in synthetischen Membranen sowie in der zellulären Plasmamembran. Unsere Studie kann in zwei Teilfragen gruppiert werden: i) Wie bewegen sich oxPL in Membranen? Für diese Frage verwendeten wir das fluoreszenzmarkierte oxPL PGPE-Alexa647, bei dem eine hydrophile Carboxyl-Gruppe eine Acylkette des Phospholipids ersetzt; die Verbindung wurde von unserem Kollaborationspartner Albin Hermetter (TU Graz) synthetisiert. In phasen-separierten Modelmembranen fanden wir heraus, dass PGPE Zugang zu nahezu allen Phasen-Zuständen - von fluiden Phasen bis zu Gel-Phasen - hatte. Dies war nicht überraschend, hat doch PGPE nur eine hydrophobe Acylkette, wodurch es weniger freie Membranfläche benötigt. Wir beobachteten auch eine wesentlich erhöhte Diffusionsdynamik verglichen mit konventionellen Phospholipiden, wiederum aufgrund der geringeren Fläche des PGPE. Daten aus lebenden Zellen zeigten ebenfalls eine erhöhte Mobilität des PGPE verglichen mit konventionellen Phospholipiden. Eine nähere Betrachtung der PGPE Diffusion zeigte interessante Interaktionen mit Cholesterin: Je höher der Cholesteringehalt der Membran war, desto besser wurde PGPE in die Lipid-Doppelschicht integriert; bei sehr hohem Cholesteringehalt erreichte es schließlich die Mobilität eines konventionellen Phospholipids. Molekular-Dynamik-Simulationen wurden in Zusammenarbeit mit Thomas Stockner (Medizinische Universität Wien) durchgeführt; sie zeigten, dass PGPE durch Cholesterin in den Zentralbereich der Membran gezogen wird, wodurch sich die Wechselwirkungsenergie mit den anderen Lipiden der Membran erhöht. ii) Wie wirkt sich das Vorhandensein von oxPL auf generelle Eigenschaften der Membran aus? Geht man von der Vielzahl an Auswirkungen von oxPL auf zelluläre Signalisierungsprozesse aus, wäre es nicht verwunderlich, wenn einige dieser Prozesse direkt an der Membran initiiert würden. In der Tat beobachteten wir, dass protein-reiche Nanoplattformen in der Plasmamembran durch Zugabe von oxPL aufgelöst werden können. Überraschenderweise zeigte sich jedoch, dass dieser Effekt nicht direkt durch oxPL vermittelt wird, sondern indirekt durch Aktivierung eines Enzyms, welches die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran verändert.