Ortsspezifisches Crosslinking mit KLK-Proteasen aus Prostata

Viele biologische Prozesse hängen davon ab, dass Proteine an andere Moleküle binden, bei denen es sich oft wieder um Proteine handelt. Manche dieser Komplexe sind sehr stabil und lassen sich strukturbiologisch analysieren. Doch gibt es auch kurzlebige Komplexe, die viel schwerer zu untersuchen sind. Die derzeitigen Verfahren zur Verknüpfung (Crosslinking) der molekularen Komponenten instabiler Komplexe sind eher unspezifisch. Daher ist es wünschens- wert, neue Ansätze zur ortsspezifischen Verknüpfung zu finden. Reaktionen der sogenannten Klick-Chemie führen an definierten Positionen zur Bildung kovalenter Bindungen, darunter die bewährte 1,3-dipolare Cycloaddition, auch bekannt als Azid- Alkin-Klickreaktion, und die für Proteine neu eingeführte Thiol-En-Kopplung. Beide Ansätze beruhen auf nicht-natürlichen Aminosäuren (nnAS), die durch Manipulation des genetischen Codes und der Proteinsynthese von Zellkulturen in ausgewählte Proteine eingebaut werden können. Als Modellsystem für die Wechselwirkung von Proteinen mit Liganden bieten sich menschlichen Gewebekallikreine (Kallikrein-related peptidases, KLKs) aus Prostata an, insbesondere KLK 2, 3, 4, 5, und 11. Diese Serinproteasen haben wichtige physiologische Funktionen bei der Befruchtung, was sich bei Erkrankungen wie Prostatakrebs ändert. Die Kenntnis von einigen KLK-Kristallstrukturen ist eine gute Voraussetzung für den ortsspezifischen Einbau von nnAS an ausgewählten Positionen der Enzyme und deren Verknüpfung mit anderen Molekülen. Dafür werden inaktive KLKs eingesetzt, welche die gebundenen Moleküle nach Klickreaktionen nicht spalten. Die beiden Ansätze der Klick- Reaktionen werden in zwei Schritten angewendet: 1. Inaktive KLK-Varianten mit reaktiven nnAS werden mit Peptiden verknüpft, die als nnAS-Reaktionspartner ein Azid und eine Alkin enthalten, bzw. ein Cystein mit einer olefinischen Seitenkette. Diese Peptide sind von natürlichen Substraten abgeleitet, für welche die Prostata-KLKs spezifisch sind. 2. Die nnAS-KLKs werden mit natürlichen Substraten verknüpft, die mittels rekombinanter Herstellung entsprechend verändert wurden. Nach Reinigung der stabilisierten Komplexe werden diese biochemisch charakterisiert und kristallisiert. Falls für die Röntgenbeugung geeignete Kristalle erhalten werden, können die Strukturen der Komplexe mit großer Wahrscheinlichkeit bestimmt werden. Die ortsspezifische Verknüpfung von Proteinen kann zu einer allgemeinen Methode für Proteinkomplexe mit anderen Molekülen entwickelt werden. Speziell in diesem Projekt können Informationen über die Elemente des Aufbaus der KLK-Proteasen gewonnen werden, die ihre Substratspezifität bestimmen, was bei der Aufklärung biologischer und krankheitsbedingter Vorgänge wie Prostatakrebs sehr wertvoll wäre. Das Wissen über diese räumliche Spezifität der KLK-Proteasen wird die Herstellung neuer Medikamente mit bislang beispielloser Wirksamkeit ermöglichen.

Biologische Systeme weisen viele kurzlebige Proteinkomplexe auf, die für Struktur- und Funktionsstudien selten in vitro erfasst werden können. Daher haben wir ein Modellsystem menschlicher Proteasen ausgewählt, die Kallikrein-related peptidases (KLKs 2, 3, 4, 11) aus Prostata, die mit ihren Substraten solche Komplexe als Übergangszustände bilden. Das Hauptziel des Projekts war die Stabilisierung solcher Komplexe durch die Etablierung eines Systems, das die kovalente Verknüpfung dieser Proteasen mit spezifischen, vorzugsweise physiologischen Substraten ermöglicht. Zwei sogenannte bioorthogonale Reaktionen der Click-Chemie, die Kupfer(I)-katalysierte 1,3-dipolare Cycloaddition (CuAAC) und die Thiol-En-Kupplung, schienen für diesen Ansatz geeignet. In der CuAAC bilden nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs) wie Azidophenylalanin (AzF) und Homopropargylglycin (Hpg) stabile Triazolbausteine, in der Thiol-En-Kupplung bildet eine olefinische ncAA wie S-Allylcystein (Sac) einen Thioether mit Cystein (Cys). Zunächst mussten orthogonale Translationssysteme (OTS) für die Expression von KLKs hergestellt werden, die ncAAs enthalten. Basierend auf molekularem Modeling mit Strukturkoordinaten wurden optimale Positionen für ncAAs mit reaktiven Seitenketten bestimmt. In einer Kooperation mit der TU Berlin wurden für beide genannten Klickreaktionen entsprechende OTS entwickelt. Ein bedeutender wissenschaftlicher Fortschritt wurde mit der Entwicklung der Stopp-Codon-Suppressionsmethode für die CuAAC erzielt, die den Einbau von ncAAs mit Azid- oder Alkin-Seitenketten ermöglicht. Durch die Entwicklung und Erzeugung von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und zugehörigen tRNAs wurde die Herstellung mehrerer OTS für den Einbau einer großen Zahl von ncAAs, oft mit unnatürlichen Seitenketten, ermöglicht. Testexpressionen von KLKs mit diesen OTS für mehrere Klickreaktionen geeignete ncAAs waren erfolgreich. Medien für die Proteinexpression wurden für die KLKs optimiert und enthielten Puffer mit neutralem pH, Mg2+ und Glucose oder Glycerin mit verbesserter Belüftung, was zu sehr hohen Zelldichten von E. coli-Kulturen führte. Dieser Ansatz funktionierte für die inaktive Ser195Ala-Mutante von KLK2 durch den Einbau von AzF in Position 215, die zur Substraterkennungsregion des aktiven Zentrums gehört. Optimierte Reinigungsprotokolle für die nativen KLKs und einige Zymogene oder pro-KLKs aus Inclusion bodies wurden bereits entwickelt. Die KLK-Proteasen wurden unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und dann in Puffergradienten auf Gelfiltrationssäulen (SEC) gefaltet. Eine anschließende SEC stellte die Reinheit und Homogenität der Proteaseproben sicher. Molekulare Modellierung und molekulardynamische Berechnungen zeigten, dass einige der nativen KLK-Proteasen mit inaktivierten katalytischen Resten in Komplexen mit großen Proteinsubstraten relativ stabil zu sein schienen. Insbesondere der Komplex von KLK2 mit pro-KLK3/PSA zeigte diese Stabilität in Simulationen. Beide Proteine sind ein physiologisches Paar von Aktivator und aktiviertem Zielprotein. Solche Komplexe und ihre kovalente verknüpften Klickprodukte aus ncAA-Komponenten sind die ersten Kandidaten für ein Kristallisationsscreening, das eine Voraussetzung für die Strukturbestimmung und damit verbundene Studien ist.