Dihydro-p-coumaroyl-CoA dehydrogenase

Dieses Projekt untersucht den ersten Schritt der Biosynthese von Phloridzin in der Modellpflanze Apfel. Phloridzin stellt mehr als 90% der löslichen phenolischen Inhaltsstoffe in Apfelblättern dar. Diese großen Mengen an Phloridzin machen den Apfel einzigartig, da viele andere Pflanzen nur sehr geringe Mengen bilden und viele eng verwandte Arten wie etwa die Birne weder Phloretin noch das nah verwandte Glukosid Phloridzin enthalten. Phloretin und Phloridzin haben viele positive Effekte auf den menschlichen Organismus, die physiologische Rolle im Apfel ist hingegen noch nicht geklärt. Eine Beteiligung bei der Resistenz gegen Krankheiten wird immer wieder diskutiert. Wir konnten zeigen, dass die Bildung von Phloridzin auf drei Biosyntheseschritten beruht: (1) die Bildung von Dihydro-p-coumaroyl-CoA aus p-Coumaroyl-CoA durch eine Dehydrogenase, (2) die weitere Bildung von Phloretin durch die Chalkonsynthase und (3) die Glukosylierung von Phloretin an der Position 2. Während die letzten beiden Schritte bereits gut untersucht sind, ist der erste Schritt noch weitgehend unbekannt. Es ist der entscheidende Schritt, der den Apfel im Vergleich zu anderen Pflanzen in seiner Fähigkeit, große Mengen an Phloridzin zu bilden, einzigartig macht. In unserem letzten FWF-Projekt (P25399-B16) konnten wir in einem aufwendigen Reinigungsverfahren erstmals ein Enzym aus Apfelblättern isolieren, das p-Coumaroyl-CoA in Dihydro-p-coumaroyl-CoA effizient umwandeln kann. Im Folgeprojekt soll dieses Enzym erstmals genau charakterisiert werden. Um den enzymatischen Mechanismus zu klären, sind Strukturstudien nötig, wie etwa die Kristallisation des Enzyms oder der Einfluss von Substraten, Inhibitoren/Effektoren oder anderen Faktoren. Die DNA- Sequenz der Dehydrogenase wird aus dem Apfel isoliert und in Bakterien eingebracht, um eine größere Menge Enzym zur Charakterisierung herzustellen. Es wird getestet, in welchen Pflanzengeweben und Entwicklungsstadien das Dehydrogenase-Gen an- bzw. ausgeschaltet ist. Die Funktionalität der Dehydrogenase wird auch mit transgenen Pflanzen überprüft, indem das Gen in die Ackerschmalwand (Arabidopsis) und in Birnenpflanzen eingebracht oder in Apfelpflanzen ausgeschaltet wird um die daraus resultierenden Veränderungen beobachten zu können. Der Vergleich der DNA- und der Enzym-Sequenz der Dehydrogenase von verschiedenen Pflanzenarten soll Auskunft über Struktur-Aktivität-Beziehungen auf molekularer Ebene geben. Die Projektmitarbeiter arbeiten in drei Teams, welche komplementäres Wissen und Ressourcen beisteuern. Ein österreichisches Team der TU Wien bringt Wissen zur Phloridzinbiosynthese, Molekularbiologie und Enzymatik ein, während das zweite österreichische Team an der Universität Wien sein Know-How zur Enzymcharakterisierung und -kristallisation beisteuert. Das deutsche Team hat langjährige Erfahrung in der wissenschaftlichen Überprüfung der Funktion einzelner Gene mittels gentechnisch veränderter Pflanzen. Zusätzlich wird ein externes Projektteam aus Neuseeland sein Know-How in Birnentransformation einbringen. Diese Arbeiten werden aber über neuseeländische Eigenmittel finanziert.

Phloridzin ist ein Inhaltsstoff der im Apfel in großen Mengen vorhanden ist, dessen Biosyntheseweg jedoch bislang nicht völlig aufgeklärt ist. Der entscheidende Schritt ist die Umwandlung der Phloridzin-Vorstufe p-coumaroyl-CoA zu Dihydro-p-coumaroyl-CoA durch ein Enzym (Dehydrogenase). In einem vorangegangenen FWF-Projekt konnten wir in einem aufwendigen Reinigungsverfahren dieses Enzym erstmals aus Apfelblättern isolieren, während im vorliegenden Projekt eine entsprechende Charakterisierung auf unterschiedlichen Ebenen erfolgte: Erstens wurde die Herstellung der Dehydrogenase in Bioreaktoren mit Bakterienzellen optimiert, das Enzym isoliert und für Aktivitätstests verwendet. Dabei wurden biochemische Charakteristika wie etwa optimale Reaktionsbedingungen, die Spezifität mit unterschiedlichen Substraten, oder die thermische und zeitliche Stabilität, etc. bestimmt. Des Weiteren wurde untersucht, wie stark die Genvarianten für das Enzym in verschiedenen Apfelsorten und -geweben (Blätter, einzelne Blütenorgane, Triebspitzen) angeschaltet ist. Dabei wurden auch sogenannte Transkriptomanalysen verwendet, mittels denen einzelne Varianten des Gens und deren Ausprägung im Apfel und weiteren Pflanzenarten analysiert werden konnten. Um die physiologische Relevanz der Dehydrogenase zu beurteilen, wurden gentechnisch veränderte Pflanzen hergestellt. Dazu wurde die Dehydrogenase ins Genom der Modellpflanze Ackerschmalwand (Arabidopsis sp.) integriert (Überexpressions-Experimente). Die transgenen Pflanzen produzierten im Vergleich zum Wildtyp neue Inhaltsstoffe, die auf die Aktivität der Dehydrogenase zurückzuführen werden können, wodurch die Aktivität des Enzyms auch in der Pflanze bestätigt werden konnte. Weiters wurden transgene Apfelpflanzen hergestellt, in denen das Gen für die Dehydrogenase ausgeschaltet werden sollte (Silencing-Experimente). Die Evaluierung der transgenen Linie ist noch nicht abgeschlossen. Insgesamt betrachtet führten die Ergebnisse des Projekts auf mehreren Ebenen zu einem besseren Verständnis der Biosynthese von Phloridzin im Apfel, insbesondere der dabei beteiligten Dehydrogenase.