Bestimmung von RNA Strukturen durch Probing und Vorhersagen

RNA Moleküle sind essentielle Bausteine des Lebens, die wichtige regulatorische Funktionen in unseren Zellen erfüllen. Dabei spielen die Strukturen dieser Moleküle eine besonders wichtige Rolle, da diese festlegen, wie RNAs miteinander und mit anderen Bestandteilen der Zelle, wie zum Beispiel Proteinen, interagieren. Kennt man also die Struktur, kann man auf die Funktion zurück schließen. In diesem Projekt arbeiten Forscher aus Österreich und Frankreich an Methoden, um diese Strukturen von RNAs zu entschlüsseln. Experten aus den Bereichen Biologie, Biochemie, Struktur Biologie, Informatik und Physik entwickeln gemeinsam neue Ansätze, um mittels experimenteller Methoden im Labor, aber auch Computerprogrammen den Geheimnissen der RNAs auf die Spur zu kommen.

Die Analyse und Modellierung der Struktur von Biomolekülen ist eine zentrale Aufgabe der Grundlagenforschung mit dem Ziel deren funktionale Eigenschaften zu identifizieren und Wirkungsweise besser zu verstehen. Dies ist nicht nur wichtig um deren Rolle in der Interaktion mit anderen Molekülen in der Zelle zu identifizieren, sondern auch ein zentraler Bestandteil bei der Entwicklung neuer Strategien in klinisch relevanten Aufgabenbereichen, z.B. bei Erkrankungen wie Krebs oder Virusinfektionen. Exakte Strukturdaten sind jedoch meist nur durch aufwändige und kostenintensive Experimente zu gewinnen, die nicht auf alle Biomoleküle anwendbar sind. Im vorliegenden Projekt lag der Fokus auf dem Biopolymer RNA und der Erforschung eines alternativen Zugangs zur Strukturbestimmung: computergestützte Vorhersagen der RNA-Sekundärstruktur, die durch experimentelle Hochdurchsatzdaten optimiert wurde. Im Zuge unserer Forschungsarbeit haben wir den Informationsgehalt solcher Daten eingehend untersucht und daraufhin einen neuen Ansatz entwickelt, der mehrere sogenannte RNA-Probing Reagenzien unter unterschiedlichen Umweltbedingungen kombiniert. Zudem haben wir eine Methode etabliert, die eine bisher nicht genutzte experimentelle Hochdurchsatzdatenquelle zur Strukturvorhersage integriert. Die bis dato gängigste Methode zur RNA-Sekundärstrukturvorhersage basiert auf einem physikalischen Modell, welches aus der Nukleotidsequenz und unter Zuhilfenahme von thermodynamischen Energieparametern die stabilste Struktur bestimmt. Solche Algorithmen sind für kurze RNAs hinreichend genau etabliert, Ergebnisse für längere Molekülen sind jedoch meist ungenau. Wir unterstützen den Ansatz, dass die Integration experimentell abgeleiteter Energieparameter aus RNA-Probingdaten, welche die Nukleotidreaktivitäten bezüglich Rückgratflexibilität oder Zugänglichkeit messen, die Vorhersage deutlich verbessern kann. Solche Daten bestehen typischerweise aus Reaktivitätswerten pro Nukleotid, die anzeigen wie flexibel das RNA Rückrad oder wie zugänglich das Nukleotid gegenüber der Reagenz war, je nach verwendeter Methode. Unsere Untersuchungen zeigten, dass die ausschließliche Nutzung eines der gängigsten RNA-Probingansätze zu Fehlinterpretationen führen können. Um diese Fehlinterpretationen zu reduzieren, haben wir im Rahmen des Projektes eine Methode entwickelt, welche die Komplementarität verschiedener Datensätze aus Experimenten mit unterschiedlichen Reagenzien und Umweltbedingungen - wie Metallionenkonzentration und Temperatur - zielführend nutzt. Insbesondere können Variationen von Faktoren wie Metallionenkonzentration und Temperatur dazu beitragen, Strukturmerkmale zu unterscheiden, die zwar experimentell gemessen, aber im Vorhersagemodell nicht korrekt abgebildet werden können, was zu einer deutlichen Verbesserung der Vorhersageleistung führt. Wechselwirkungen zwischen RNAs werden typischerweise durch sogenannte Crosslinking-Experimente untersucht, bei denen Sequenzierungsdaten entstehen, die jeweils von unterschiedlichen RNAs stammen. Zur Unterstützung der Sekundärstrukturvorhersage haben wir eine Methode entwickelt, die stattdessen jene Daten (Reads) nutzt, die auf entfernte Regionen derselben RNA abgebildet werden. Dieser Ansatz übertrifft herkömmliche RNA-Probing Techniken, da er zweidimensionale Informationen über intramolekulare Wechselwirkungen liefert, die für eine präzise Strukturmodellierung entscheidend sind. Durch unsere methodische Erweiterung der verfügbaren strukturrelevanten Daten eröffnet unser Ansatz präzisere und skalierbare Analysen - ein wesentlicher Schritt zum besseren Verständnis der Rolle von RNA auch mit Blick auf die Etablierung innovativen Behandlungsmethoden.