Neue chemoenzymatische Route von Säuren zu Nitrilen

Nitrile sind vielseitige chemische Verbindungen. Citronellylnitril, zum Beispiel, verströmt einen zitronenartigen Duft und wird häufig in Haushaltsreinigern eingesetzt. Der typische Weg um Nitrile herzustellen besteht aus der chemischen Reaktion bestimmter Moleküle mit Zyanid. Zyanid ist aber hochgiftig. Agatha Christie lässt ihre fiktiven Mörder gerne zu Zyanid greifen: Ein wenig unscheinbares, weißes Pulver in ein Glas Sekt, und schon nimmt Blausäure den Opfern die Luft zum Atmen. Die Verwendung von Zyanid wird überflüssig, wenn man Nitrile mit Hilfe von Enzymen herstellt. Diese Biokatalysatoren sind ungiftig und arbeiten bei ökologisch vertretbaren, milden Bedingungen. Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es, gleich zwei Enzyme (Carboxylatreduktasen und Aldoximdehydratasen) und eine einfache chemische Reaktion zu einer Kaskade zu verbinden: Aus Säure wird Aldehyd, daraus ein Oxim, das wiederum in das Zielprodukt das Nitril umgewandelt wird. Carboxylatreduktase-Enzyme können aus einer Säure selektiv den Aldehyd machen, sie brauchen aber biologische Cofaktoren als Energielieferanten. Letztere kann man nicht einfach zu einer Reaktion zugeben, da sie viel zu teuer wären. Wenn wir die Reaktion aber in einem Mikroorganismus ablaufen lassen, so ist dieses Problem gelöst, da die Zellen die nötigen Cofaktoren ganz einfach aus Zucker und Sauerstoff bilden. Das Produkt dieser ersten enzymatischen Stufe der Aldehyd ist sehr reaktiv und wird sogleich über chemische Kondensation mit Hydroxylamin als Oxim abgefangen. Das Oxim wiederum wird von einer Aldoximdehydratase als Substrat erkannt. Dieses Enzym ist erstaunlicherweise in der Lage, das Nitril unter Wasserabspaltung in wässriger Lösung freizusetzen! Dies ist eine ausgesprochen milde Alternative zur klassisch chemischen Wasserabspaltung. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, das Bakterium Escherichia coli dazu zu bringen, die oben dargelegte Kaskadenreaktion zu Nitrilen zu katalysieren. Unsere Methode wird nicht nur für die Herstellung duftender Nitrile, sondern auch für die Synthese pharmazeutischer Wirkstoffe einsetzbar sein. Als besonders wichtiges Projektergebnis erwarten wir ein deutlich besseres Verständnis des Zusammenspiels von Enzymen und Chemikalien im lebenden Mikrooganismus. Dieses Wissen wird uns nicht nur helfen, Schwachstellen in unserer Kaskade zu identifizieren und zu beheben, sondern auch, andere Kaskaden mit Aldehyden als Zwischenprodukt zu verbessern. Aus Genom- Sequenzierungsprojekten wissen wir, dass Gene von hunderten bakteriellen und pilzlichen Aldoximdehydratasen in Datenbanken schlummern. Erst eine Handvoll dieser Enzyme wurde bis jetzt untersucht und eines unserer Ziele ist es, herausragende neue Aldoximdehydratasen zu finden. Daher erwarten wir als weiteres Resultat unserer Arbeit tiefgreifendes Wissen über die, bis dato, ziemlich unerforschte Enzymklasse der Aldoximdehydratasen und neue Varianten dieser hochinteressanten Biokatalysatoren.

Wenn der Haushaltsreiniger einen zitronenartigen Duft verströmt, dann kann das an einem Nitril namens Citronellylnitril liegen. Auch bei der Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen, Sekundenklebern oder chemikalienresistenten Handschuhen kommen diese vielseitigen chemischen Nitril-Gruppen zum Einsatz. Für das bisher gängige Herstellungsverfahren benötigte es eine chemische Reaktion bestimmter Moleküle mit hochgiftigem Zyanid. Um das Zyanid zu ersetzen, greifen wir auf Enzyme zurück und verbinden drei einzelne Reaktionen zu einer Kaskade. Ausgangsstoff sind Carbonsäuren, etwa Fettsäuren aus Ölen oder Lignin, das als Reststoff in der Holzverarbeitung anfällt. Im ersten Schritt wird die Carbonsäure durch Zugabe von Zucker, Sauerstoff und dem in lebenden Bakterienzellen enthaltenen Enzym Carbonsäurereduktase zu einem Aldehyd gewandelt. Dieses Aldehyd ist allerdings hoch reaktiv und dadurch instabil, in vielen Fällen noch dazu flüchtig. Um diesen Stoff abzufangen, lässt man das Aldehyd mit Hydroxylamin reagieren, wodurch es zu stabilem Oxim umgesetzt wird. Oxim ist eine gewässerte Form des Nitrils, weswegen im letzten Schritt das Enzym Aldoxim Dehydratase zum Einsatz kommt. Auch dieses befindet sich in Bakterienzellen und sorgt dafür, dass dem Oxim das Wasser entzogen wird. Ist dies geschehen, hat die Kaskade ihr Ziel erreicht und das gewünschte Nitril ist hergestellt. Für kleine Mengen ist diese Methode bereits gut einsetzbar. Das wäre etwa bei sehr potenten Duftstoffen der Fall, von denen nur wenig benötigt wird, um einen Effekt zu erzielen. Für die Herstellung größerer Nitrilmengen ist noch Optimierungsarbeit notwendig, um den biokatalytischen Prozess zu vertretbaren Kosten nutzen zu können. Aktuell kommen im ersten Prozessschritt stark verdünnte Lösungen zum Einsatz und es benötigt einen großen Reaktor, um Großmengen zu produzieren. Das ist allerdings teuer, daher sollte noch daran geforscht werden, den ersten Schritt effizienter zu gestalten. Die Dehydrierung des Oxims alleine ist hingegen ausgesprochen effizient und bereits heute technisch reif für die Produktion. Im Zuge unserer Forschung haben wir sehr viel Neues über die beteiligten Enzyme gelernt und ihre Vorlieben, sowie verschiedenste Szenarien durchgespielt, wie die Kaskade möglichst effizient zu nutzen wäre.