Mikrofluidik-Impedanz-Biosensor für Blutgerinnung

In der klinischen Gerinnungsdiagnostik besteht ein großer Bedarf an tragbaren Geräten zur Bestimmung des Blutgerinnungsstatus. Nicht kontinuierliche oder ungenaue Messungen können zu Blutungen oder lebensbedrohlichen Thrombosen führen. Die herkömmlichen Systeme sind entweder mit langen Analysezeiten verbunden oder erfordern eine Probenvorbereitung, teure Geräte und qualifiziertes Personal. So sind sie für den Vor-Ort-Einsatz meistens nicht geeignet. Zudem reichen Befunde, basierend auf einem einzigen Biomarker, oft nicht aus, um eine korrekte Diagnose zu stellen. Daher ist es sehr wünschenswert, mehrere Biomarker gleichzeitig zu messen. Ziel dieses Projektes ist die Implementierung eines Mikrofluidik-Impedanz-Biosensors mit Aptameren, der die simultane und label-freie Vor-Ort-Detektion des Blutgerinnungsstatus ermöglicht. Aptamere können ihr Zielmolekül dank ihrer 3D-Struktur mit hoher Spezifizität und Affinität erkennen. Impedimetrische Biosensoren erlauben eine label-freie Detektion biomolekularer Interaktionen. Ihr relativ einfacher Aufbau und der hohe Miniaturisierungsgrad favorisieren diese Methode für die Entwicklung von tragbaren Systemen. Die Empfindlichkeit von aktuellen impedimetrischen Sensoren ist meist durch den Einfluss der Ionenstärke der Probe limitiert. Mit dem Einsatz unseres Nanogap-IDA Sensors kann dieser Einfluss des Mediums auf die Messung reduziert werden. Eine erfolgreiche Demonstration eines solchen Mikrofluidik-Impedanz-Biosensors mit Aptameren würde einen Paradigmenwechsel in der Blutgerinnungsdiagnostik bedeuten. Dieses System könnte aber auch in anderen Anwendungsbereichen eingesetzt werden und in Zukunft sogar die Echtzeit- und Online-Monitoring von Biomarkern erlauben.

Das Ziel dieses Projektes war es, ein Mikrofluidik-Impedanz-Biosensor-System für die label-freie patientennahe Labordiagnostik (POCT) zu entwickeln, welches erlaubt, verschiedene Blutgerinnungsmarker im Blut zu bestimmen. Dies soll eine genauere Bestimmung der Blutgerinnung während oder nach einer Behandlung (z.B. nach einer Herzoperation oder Dialyse) ermöglichen, um lebensbedrohliche Thrombosen zu verhindern. Der entwickelte Mikrofluidik-Biosensor-Chip soll dabei die derzeitige lange und zeitintensive Blutanalyse ersetzen. Die Probenpräparation (Aufbereitung des Vollblutes in Blut und Plasma) wird komplett durch den Mikrofluidik-Chip ersetzt. Das Blutplasma ist der wichtigste Informationsspeicher unseres Organismus und liefert wichtige Informationen über das hämostatische Gleichgewicht des Körpers und enthält eine Unmenge an wichtigen Biomarker wie Proteine, Enzyme, kleine Moleküle und Nukleinsäuren. Für eine reproduzierbare Messung der Biomarker ist ultrareines Plasma notwendig, da ansonsten die Blutzellen mit den hochsensitiven elektrochemischen Messungen interferieren würden. Mit dem entwickelten Mikrofluidik-Chip ist es uns gelungen kontinuierliche und ohne Verwendung eines Filters oder einer Zentrifuge das hochreine Blutplasma zu extrahieren. Dabei wurden für die passive Separations-Methode zwei hydrodynamischen Effekten ausgenutzt (Fahraeus-Lindqvist Effekt und Zweifach-Fung Effekt). Die Mikrofluidik-Geometrie wurde dabei mittels COMSOL Multiphysics-Software simuliert und anschließend gefertigt. Dabei wurden mikrotechnische Fertigungstechniken sowie konventioneller 3D-Druck angewendet. Die so gefertigten Mikrofluidik-Chips weisen eine hervorragende Separierung (99,9%) über einen sehr großen Durchflussraten-Bereich (0,05 - 0,2 ml/min) auf. Die Hämolyse-Messungen zeigen bessere Ergebnisse als jene, die bei der Trennung mittels Zentrifugation erzielt werden. Der Mikrofluidik-Chip zur Blutplasmagewinnung, bestehend aus Polydimethylsiloxan (PDMS), wurde im nächsten Schritt mit den in Silizium realisierten Elektrodenstrukturen zur Detektion verbunden. Die Detektion erfolgt in einem nachgelagerten Bereich des Chips, unmittelbar nach der Separierung. Um die Biomarker Thrombin, Fibrinogen, Plasmin und Beta-Thromboglobulin nachzuweisen, wurde für jeden dieser Biomarker ein spezielles Aptamer ausgewählt. Zur Auswahl der Aptamere wurde die SELEX-Methode (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) verwendet. Die besten Aptamere wurden durch Bindungstests, die mit einer quantitativen RT-qPCR durchgeführt wurden, identifiziert. Um besonders gute Aptamere zu finden, wurde der Selektionsdruck erhöht, sodass vor allem solche Aptamere verstärkt wurden, die stark und gezielt an das jeweilige Protein binden. Diese Aptamere wurden anschließend mit Hilfe der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle ausgewählten Aptamere spezifisch an ihre Zielproteine binden, während die Negativkontrollen (bovines und humanes Serumalbumin) keine Signale zeigten. Aktuell entwickeln wir ein innovatives Assay zur zuverlässigen Detektion von Blutgerinnungsindikatoren mittels unterschiedlichen Aptamere. In diesem Zusammenhang evaluieren wir parallel verschiedene Interdigital-Elektroden-Designs - darunter Nano- und Mikrogap-Strukturen -, um die Sensitivität und Spezifität des Systems weiter zu optimieren. Ziel ist es, eine robuste und vielseitig einsetzbare Plattform zu etablieren, die sowohl technologisch als auch analytisch höchsten Anforderungen gerecht wird.