Zelloberflächen-Cluster von MHC Klasse I Molekülen

Antragssteller FWF: Dr. Peter Lanzerstorfer, Fakultät für Technik und Angewandte Naturwissenschaften, Fachhochschule Oberösterreich, Österreich. Antragssteller DFG: Univ. Prof. Dr. Sebastian Springer, Department of Life Sciences and Chemistry, Jacobs University Bremen, Deutschland. MHC-Klasse I-Proteine (MHC-Proteine) sind auf der Oberfläche nahezu aller Zelltypen zu finden und dienen hauptsächlich der Antigenpräsentation für zytotoxische T-Zellen (T-Killer-Zellen). Infizierte und entartete Zellen, die körperfremde Proteine herstellen, können somit gezielt von den T-Killer-Zellen identifziert und anschließend eliminiert werden. MHC-Proteine sind daher essentiell wichtig für die zelluläre Immunität gegen Viren, intrazelluläre Bakterien und Tumore. Die Zelloberflächenform des MHC-Proteins, die den T-Zell-Rezeptor bindet, ist ein nicht-kovalenter Proteinkomplex, bestehend aus folgenden drei Untereinheiten (Trimer): der an der Zellmembran verankerten schweren Kette (heavy chain, HC), der kleineren löslichen Untereinheit Beta-2- Mikroglobulin (ß2 m) sowie einem antigenen Peptid. Unter physiologischen Bedingungen dissoziiert das an der Zelloberfläche präsentierte Peptid nach einigen Stunden bis Tagen vom Trimer (je nach Affinität), und ein `leeres Dimer` aus HC und ß2 m bleibt bestehen. Hiervon dissoziiert ß2 m innerhalb von wenigen Minuten, und die freie HC (FHC) bleibt zurück. Wir konnten kürzlich zeigen, dass FHCs an der Zelloberfläche sich zu Clustern zusammenlagern. Diese Cluster bestehen aus mehreren FHCs, die in cis (auf der gleichen Membran) interagieren. Die Cluster- Ausbildung wurde zum ersten Mal mittels einem Two-Hybrid Antikörper-Micropattern-Assay nachgewiesen. Unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass die 3 -Domäne der FHC für die Wechselwirkung ausreichend ist. Weiters scheint es so zu sein, dass die FHC-Cluster von transienter Natur sind, hauptsächlich aus Protein-Dimeren bestehen und für eine effiziente Endozytose von MHC- Proteinen verantwortlich sind. Auch mögliche Funktionen bei der Übermittlung von Stress-Signalen an andere Zellen des Immunsystems sind diskutiert, aber noch nicht bewiesen, worden. Im vorliegenden Projekt sollen nun folgende Punkte geklärt werden: i) Welche MHC-Allotypen unterliegen der FHC-Cluster Ausbildung?, ii) Wie werden die FHC-Cluster räumlich ausgebildet und welcher Dynamik unterliegen sie?, und iii) Was ist die biologische und physiologische Funktion der Cluster? Zur Beantwortung der Fragestellungen werden verschiedene methodische Ansätze angewendet. Um FHC-Cluster zu detektieren bzw. erste Aufschlüsse über die Interaktionsdynamik zu bekommen, wird ein adaptierter Antikörper-Micropattern Assay verwendet. Die räumliche Aufklärung der potentiellen Cluster wird mittels in-silico-Modellen und Röntgenkristallographie bewerkstelligt. Einzelmolekülspektroskopie wird in weiterer Folge detaillierten Aufschluss über die Größe, Dynamik und Affinität der Cluster geben. Das Projekt legt somit den Grundstein für eine systematische Untersuchung der physiologischen Rolle von Peptid-freien MHC-Klasse I-Molekülen an der Zelloberfläche.

Immunproteine bilden Komplexe, um an der Zelloberfläche zu bleiben und nicht abgebaut zu werden. Das hat die Gruppe von Peter Lanzerstorfer (FHOÖ) in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Sebastian Springer (Universität Bremen) herausgefunden. MHC-Proteine wirken wie die sprichwörtliche rote Flagge auf virusinfizierten oder krebsartigen Zellen, um das Immunsystem auf eine Krankheit aufmerksam zu machen. Unklar war bis jetzt jedoch, was die Lebensdauer dieser MHC-Proteine steuert. Wie lange bleiben sie an der Zelloberfläche? Wie werden sie entsorgt? Oder werden sie recycelt und wiederverwendet? In diesem Projekt haben wir einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klärung dieser Fragen gemacht. Wir untersuchten eine bestimmte Form der MHC-Proteine, die so genannte freie schwere Kette (free heavy chain, FHC), weil wir zuvor festgestellt hatten, dass sich FHCs an der Zelloberfläche zu Clustern zusammenschließen. In diesem Projekt ging es nun um die Frage, welche Rolle diese Cluster in diesem Zusammenhang haben. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Cluster etwas mit der Endozytose der MHC-Proteine zu tun haben, d. h. mit ihrer Wiederaufnahme in das Zellinnere. Um diese Hypothese zu testen, machten wir uns die Tatsache zunutze, dass MHC-Proteine zwischen verschiedenen Menschen stark variieren. Es wurde untersucht, ob diese Varianten eine unterschiedliche Tendenz zur Clusterbildung und/oder eine unterschiedliche Lebensdauer an der Zelloberfläche aufweisen bzw. ob diese beiden Eigenschaften in irgendeiner Weise zusammenhängen. Zu diesem Zweck haben wir eine neue Methode entwickelt, um die Cluster unter dem Mikroskop zu betrachten. Wir haben eine Glasplatte mit Antikörper-Mikromustern beschichtet, die sich an den MHC-Molekülen festhalten. In weiterer Folge konnte so beobachtet werden, wie sich andere MHC-Moleküle um sie herum anordnen. Mit diesem Ansatz konnten wir die Tendenz zur Clusterbildung für jede MHC-Variante einzeln untersuchen. Wir fanden heraus, dass eine MHC-Variante mit der Bezeichnung H-2Kb besonders zur Bildung von Clustern neigt, während eine andere Variante, H-2Ld, nur wenige bis gar keine Cluster bildet. Gleichzeitig hat die Gruppe von Sebastian Springer in Bremen die Lebensdauer der gleichen MHC-Varianten an der Zelloberfläche mittels Durchflusszytometrie gemessen. Dazu stoppten sie den Transport von MHC-Proteinen aus dem Zellinneren an die Oberfläche und beobachteten anschließend, wie die MHC-Proteine, die sich bereits an der Zelloberfläche befanden, langsam ins Zellinnere transportiert werden. Dabei stellten sie fest, dass H2Ld schnell endozytiert wird, während H-2Kb lange Zeit an der Oberfläche verbleibt. Dies deutet darauf hin, dass die Clusterbildung die MHC-Proteine an der Zelloberfläche hält. Um diese Hypothese zu testen, verbanden sie in einem Kontrollexperiment zwei H-2Ld-Moleküle mit einem künstlichen Linker, was tatsächlich in einer längeren Verweildauer auf der Oberfläche resultierte. Als Nächstes soll untersucht werden, wie diese Unterschiede zwischen den MHC-Proteinvarianten zu ihrer immunologischen Funktion wie der Aktivierung von Immunzellen gegen Krebs beitragen.