Hfq Aptamere in antisense Transkripten

Damit Zellen kontrolliert wachsen können, muss die Synthese aller ihrer Genprodukte streng reguliert werden. Bis vor Kurzem haben sich die Untersuchungen zur Regulation der Genexpression hauptsächlich auf regulatorische Proteine beschränkt. In den letzten Jahren jedoch sind hunderte regulatorische RNAs entdeckt worden, welche die Expression der Gene auf allen Ebenen regulieren. Wir haben einen alternativen Ansatz gewählt um neue RNAs zu entdecken: Genomisches SELEX. Wir haben dabei eine große Anzahl von genomischen Hfq Aptameren entdeckt, die auf dem antisense Strang von Protein kodierenden Genen von E. coli liegen. Diese Aptamere sind besonders gegenüber der Translationstartstelle und gegenüber des Zwischenraums von polycistronischen Genen angereichert. Wir stellen die Hypothese auf, daß diese Aptamere an der Translationsregulation und Stabilität der dazugehörigen mRNAs oder an der differenziellen Expression von polycistronischen Genen beteiligt sind. Anderenfalls könnten diese Hfq Aptamere auch die Aufgabe haben, die Expression dieser antisense Transkripte niedrig zu halten. Wir wollen diese Hypothesen testen, in dem wir das E. coli Antisensetranskriptom unter unterschiedlichen Wachstums- und Stressbedingungen bestimmen und die Rolle der Hfq Aptamere aufklären. Diese Arbeiten könnten lange antisense Transkripte als eine zusätzliche Klasse von RNA Molekülen etablieren, welche die Translation und/oder das transkriptionelle Silencing kontrollieren.

Bakterien sind einfache einzellige Organismen, die sich schnell an veränderte Umweltbedingungen anpassen müssen. Sie müssen schnell auf Umweltsignale reagieren in dem sie die Genexpression steuern. Das RNA-bindende Protein Hfq spielt eine Schlüsselrolle in diesen Adaptationsprozessen. Wir haben in diesem Projekt eine sehr detaillierte Analyse des Hfq-abhängigen Transkriptoms durchgeführt um die Dynamik der genetischen Anpassung zu verstehen.Bakterien haben im Vergleich zu höheren Eukaryonten sehr kompakte Genome; die Information in diesen Genomen ist sehr dicht und oft überlappen Protein-kodierende Gene. Durch einen enormen Aufschwung in neuen Technologien, die es möglich machen ganze Transkriptome aus Zellen von unterschiedlichen Wachstumsbedingungen zu bestimmen, wurde es schnell klar, dass Bakterien wesentlich mehr unterschiedliche Transkripte produzieren als ursprünglich aus der Perspektive der kanonischen Protein-kodierenden Gene angenommen. Viele neue antisense Transkripte wurden entdeckt und vielen von ihnen binden an das RNA Chaperon Hfq.Mit Hilfe dieser neuen Technologien haben wir Hfq-bindende RNAs, Hfq-abhängige RNAs, funktionelle antisense RNAs und RNAs, dessen 5 Prozessierung Hfq anhängig ist aus E. coli bestimmt. Wir haben Protokolle für die Erstellung von spezifischen RNA Bibliotheken entwickelt, welche spezifische Antikörper zur Anreicherung von doppel-strängiger RNAs und Hfq-bindenden RNAs benutzen. Zusätzlich haben wir die 3 Enden der Transkripte aus unterschiedlichem genetischen Hintergrund wie Hfq- und RNase III- defizienten E. coli Zellen en masse bestimmt. Wir haben total RNA aus logarithmisch wachsenden und stationären Zellen bestimmt und aus Zellen die in Anwesenheit des Rho-Inhibitors Bicyclomycin bestimmt. Die Ergebnisse der Sequenzierungen wurden mittels Northenblotting bestätigt. Zusätzlich haben wir einen sensitiven Assay entwickelt um die Promotoren der neu entdeckten antisense RNAs zu bestimmen und konnten dadurch zeigen, dass die neu entdeckten antisense RNAs tatsächlich existieren und mit komplementären RNAs doppelstrang RNAs bilden und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit funktionell sind.Zusammenfassend können wir feststellen, dass dieses Projekt ein sehr detailliertes Bild der Rolle von Hfq in der Bildung der bakteriellen Transkriptome erstellt hat. Hfq beeinflusst ca 20% aller E. coli RNAs indem es ihre Expression rauf oder runter reguliert, indem ihre 5 Enden differenziell prozessiert werden oder indem sie doppel-strängige RNAs bilden.