Charakterisierung der C. elegans piRNA Prozessierung

Kleine RNA-Moleküle können als Regulatoren in der Genexpression wirken. Die präzise Erkennung von Zielmolekülen basiert auf der Basenpaarung, so dass die kleinen RNAs als Spezifitätsfaktoren fungieren und ihre Herstellung daher genauestens kontrolliert werden muss. Einer der gut konservierten Wege, der unter der Verwendung von kleinen RNAs die die Genexpression ausschaltet, ist der so genannte Piwi-Weg. Dieser Weg ist eines der wichtigsten Überwachungssysteme in Keimzellen, um mobile Elemente (Transposons) unter Kontrolle zu halten, und wird von kleinen RNAs, den so genannten piRNAs, gesteuert. Angesichts der großen Vielfalt und Variabilität der Transposonsequenzen muss das piRNA- Sequenzrepertoire gut kontrolliert werden, um die Erkennung von wirtseigenen Transkripten zu vermeiden. Dies geschieht durch die selektive Auswahl bestimmter Transkripte als piRNA-Vorläufer, gefolgt von verschiedenen Verarbeitungsschritten. Dabei sind weder der Selektionsprozess noch die Prozessierungsschritte allgemeinen gut verstanden. Im Fadenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans) werden die piRNAs ausgehend von spezifischen, kurzen RNA-Polymerase-II-Transkripten gebildet. Anschließend werden sie von einem speziellen Proteinkomplex namens PETISCO gebunden, der die Verarbeitung ihres 5`- Endes durch eine noch nicht identifizierte Nuklease ermöglicht. Ob es sich bei diesem Schritt um eine Abfolge verschiedener Aktivitäten handelt, wie z. B. das Entfernen der Kappenstruktur, gefolgt von exoribonukleolytischem Abbau, oder ob er von einer bestimmten die Endoribonuklease katalysiert wird, ist unbekannt. Wir präsentieren vorläufige Daten, die darauf hindeuten, dass die Endoribonuklease aus einem heterodimeren Proteinkomplex besteht, der spezifisch gegenüber PETISCO- gebundene piRNA-Vorläufer in C. elegans aktiv ist. Die vorgeschlagenen Arbeitspläne zielen darauf ab, diese Hypothese zu untermauern und diese neuartige enzymatische Aktivität grundlegend zu verstehen. Wir wollen die dreidimensionale Struktur des Enzyms bestimmen und verstehen wie es mit PETISCO zusammenarbeitet. Darüber hinaus haben wir zwei weitere Faktoren identifiziert, die bei der piRNA-Biogenese eine Rolle spielen und auf Domänenebene Proteinen ähneln, die dimere Endonuklease bilden. Unsere Daten deuten auf eine mögliche modulare heterodimere Zusammensetzung von anderen Arten von Nukleasen hin, die auf einer der beiden Untereinheiten der piRNA-Prozessierungsnuklease basieren. Unser Ziel ist es, die Funktion(en) dieser Komplexe sowohl auf biochemischer als auch auf organismischer Ebene zu verstehen.

Wie Zellen ungewöhnliche RNA-Moleküle schützen und verarbeiten In jeder unserer Zellen werden die Gene fortlaufend in RNA-Moleküle umgeschrieben. Viele dieser RNAs sind kurzlebig und müssen gezielt geschützt werden, damit sie ihre Aufgabe erfüllen können, bevor sie wieder abgebaut werden. Besonders wichtig ist das in den Keimzellen, aus denen Eizellen und Spermien entstehen und in denen das Erbgut an die nächste Generation weitergegeben wird. Das Erbgut ist ständig durch sogenannte springende Gene bedroht. Das sind kleine parasitäre Abschnitte, die sich im Genom vermehren und es schädigen können. Zellen wehren sich dagegen mit winzigen RNA-Molekülen, den piRNAs, die diese Eindringlinge stilllegen. Damit eine piRNA entsteht, muss zunächst eine Vorläufer-RNA an genau der richtigen Stelle zurechtgeschnitten werden. Welches Werkzeug diesen präzisen Schnitt ausführt, war lange unbekannt. In der Förderperiode haben unsere beiden Arbeitsgruppen dieses Werkzeug entdeckt. Wir entdeckten ein Enzym, das wir PUCH genannt haben und das die Vorläufer-RNA an der entscheidenden Stelle schneidet. Überraschend war, dass PUCH an den Mitochondrien der Zelle sitzt. Genau dort arbeitet auch ein völlig anderes Enzym in Insekten und Säugetieren, das dieselbe Aufgabe erfüllt. Die Natur hat also zweimal unabhängig voneinander denselben Ort für diesen Vorgang gewählt, ein Hinweis darauf, wie wichtig er ist. Ebenso wichtig ist der Schutz der empfindlichen Vorläufer-RNA, bevor sie geschnitten wird. Hier kommt ein Eiweißkomplex namens PETISCO ins Spiel. Er lagert sich an die Vorläufer-RNA an und bewahrt sie vor vorzeitigem Abbau, sodass ausreichend Material zur Herstellung von piRNAs zur Verfügung steht. PETISCO hat noch eine zweite, ganz andere Aufgabe. Es schützt eine weitere kurzlebige RNA, die die Mutter in ihre Eizellen einlagert und für die allerersten Schritte der Embryonalentwicklung benötigt wird. Fehlt dieser Schutz, sterben die Embryonen ab. Ein und derselbe Komplex übernimmt also zwei unterschiedliche Schutzaufgaben. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, wie Zellen ungewöhnliche RNA-Moleküle erkennen, schützen und verarbeiten. Da Störungen im piRNA-System beim Menschen mit Unfruchtbarkeit in Verbindung stehen, tragen diese grundlegenden Erkenntnisse langfristig auch zum Verständnis der menschlichen Fortpflanzung bei.