Strukturelle&funktionelle Basis presynaptischer Plastizität

Langfristige Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit sind ein Grundgerüst für die Lernfähigkeit sowie für das Gedächtnis. Jene synaptischen Veränderungen betreffen vor allem postsynaptische Rezeptoren und Strukturen. Über präsynaptische Modifikationen, welche Stunden oder Tage nach einer vergangenen Aktivierung auftreten können, ist jedoch wenig bekannt. Unser Ziel ist es, die funktionellen und strukturellen Veränderungen innerhalb einer einzelnen präsynaptischen aktiven Zone (AZ) nach einer gut dokumentierten Form der Langzeitpotenzierung im Kleinhirn zu charakterisieren. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass jede AZ mehrere Andockstellen enthält, an denen synaptische Vesikel binden können, bevor sie freigesetzt werden. Um die Zusammenhänge zwischen spannungsabhängigen Kalziumkanälen (VGCCs) und Andockstellen nach einer Forskolin- Behandlung sowie train-induzierter LTP zu analysieren, wird die Optogenetik eingesetzt. Die untersuchten Synapsen werden von parallelen Fasern (PFs) auf Purkinje-Zellen (PCs) und auf Molekularschicht-Interneuronen (MLIs), mit cAMP-abhängiger LTP, gebildet. Die Experimente sind in 5 Arbeitsbereiche unterteilt, die parallel von den beiden Partnern Ryuichi Shigemoto vom Institute of Science and Technology Austria (ISTA) und Alain Marty von der Université de Paris durchgeführt werden. Ryuichi Shigemoto hat ein quantitatives SDS-verdautes Gefrierbruch-Replika-Labeling entwickelt, welches eine hohe Effizienz und eine Auflösung im Nanobereich aufweist. Wir verwenden diese Methode, um die Anzahl der VGCCs und ihren Abstand zu den fusionierten Vesikeln in der AZ-Membran zu untersuchen. Dabei werden PFs in vivo und in vitro optogenetisch stimuliert und mit der neu entwickelten Flash & Freeze-fracture-Methode analysiert. Für die Quantifizierung der angedockten Vesikel, wird auch konventionelle 3D- Rekonstruktion angewendet. Alain Marty hingegen, entwickelte elektrophysiologische Techniken, welche in unserem Projekt eingesetzt werden, um die Anzahl der Andockstellen in einem einzelnen AZ zu bestimmen, und in weitere Folge ihre Funktion bei der kurzfristigen synaptischen Plastizität zu charakterisieren. Des Weiteren werden wir die Veränderungen in der präsynaptischen Kalzium-Signalübertragung während der frühen und späten Phasen der LTP mit einer Zwei-Photonen-Mikroskopie untersuchen. Die genannten Methoden sind sehr vielversprechend und ergänzen sich gegenseitig. In früheren Zusammenarbeiten konnten wir sie bereits kombinieren und zeigten, dass jedes AZ-VGCC Cluster eine Andockstelle definiert. Mit dem neuen Projekt werden wir an diesen Ergebnissen anschließen und unsere Studie nun erweitern. Dabei versuchen wir die Mechanismen der LTP aufzuklären, indem wir transgene Tiere für die optogenetische Stimulation von PFs verwenden. Mit Cre-abhängige Exon-Switching- Mäusen können wir auch die Rolle zweier präsynaptischer VGCCs Splice Varianten (EFa und EFb) während der LTP untersuchen. Dieses Projekt wird uns zum ersten Mal genauere Einblicke in die strukturelle und funktionelle Ansicht der langfristigen synaptischen Plastizität an einzelnen AZs zentraler Säugetiersynapsen sowie in die zellulären Mechanismen, welche der präsynaptischen LTP zugrunde liegen, gewähren.