Biomarker und antifungale Resistenz in Aspergillus

Die invasive Aspergillose (IA) ist eine Infektionskrankheit, welche mit einer hohen Sterblichkeit verbunden ist. Betroffen sind vorwiegend Patienten mit hämatologischen Grundkrankheiten und/oder Organtransplantationen, Chemotherapie und Immunschwäche. Die jährlichen Kosten, Pilzinfektionen in Europa zu behandeln, belaufen sich auf etwa 200 Millionen Euro. Zurzeit gibt es keine sensitiven und spezifischen Tests, die es ermöglichen, invasive Pilzinfektionen frühzeitig zu diagnostizieren. Resistenzen gegenüber den herkömmlichen Pilzmedikamenten nehmen stetig zu und sind auch verantwortlich für ein Therapieversagen. Dieses Konsortium wird in einem multifaktoriellen Ansatz verschiedene in vitro Test-assays etablieren und evaluieren; der Einsatz von Biomarkern zur Prävention, Diagnostik und Therapie der invasiven Aspergillose steht im Mittelpunkt. Dazu bedarf es der multimodalen Analysen fungaler Marker (RNA, Polysaccharide, Proteine), Host-Faktoren einschließlich Zytokin- Profile und genetischer Prädisposition. Vorhandene diagnostische Parameter werden in die Analyse, eingeschlossen um die Beurteilung neuer Entwicklungen gewährleisten zu können. 1. Definition von A. fumigatus Biomarker. Dieses WP konzentriert sich auf die Detektion von Aspergillus- Biomarkern während der Frühphase einer Infektion. Während des Wachstums sondern Pilze eine Vielzahl von Substanzen ab, welche auch im infizierten Organ bzw. im Serum/Blut zu detektieren sind. Es soll die Kinetik von fungaler DNA, mRNA, Proteinen und Polysacchariden untersucht werden. Ein Hauptziel ist die Entwicklung eines sensitiven und gewerblich verfügbaren, standardisierten Tests, welcher auf der Nukleinsäure-Quantifizierung (bMx in der Kollaboration mit MUI und anderen) beruht. Dazu müssen entsprechende Protokolle entwickelt werden, die die optimale Extraktion, Reinigung, Amplifikation und Detektion der Nukleinsäuren von A. fumigatus erlauben (mRNA und DNA-Targets werden untersucht). Diverse Prototypen werden anhand von biologischen Proben (Vollblut, Seren, BAL) evaluiert. 2. Detektion und Identifizierung von Antimykotika-resistenten Aspergillen. Es werden neue Antimykotika gebraucht, da die Zahl von Patienten, welche mit Antimykotika-resistenten Pilzen infiziert sind, stetig steigt. Vorhandene Medikamente sind nur begrenzt gegen die Vielzahl der pilzlichen Erreger wirksam. Die molekulare Ursache der Resistenz ist nur teilweise bekannt, die Kenntnis der Resistenzmechanismen hilft aber in der Entwicklung neuer Substanzen. Weiters müssen Tests die rasche Identifikation von Resistenzen ermöglichen, um eine frühzeitige optimale Therapie zu gewährleisten. Wir werden Labormutanten in Aspergillus spezies (Resistenz gegenüber Polyene, Candine und Azole) induzieren und charakterisieren; genetische und biochemische Studien, Resistenztestungen, und Untersuchungen zur in vivo und in vitro Korrelation werden im Maus-Modell durchgeführt. Auch klinische Azol- und Candinresistente Aspergillen werden charakterisiert. Die Sequenzierung der CYP51 und FKS1 Gene identifiziert Mutationen gegenüber Azole bzw. Candine; diese Ergebnisse sind für Partner IP wichtig, der für den raschen Nachweis entsprechende Microarrays designen wird. Genexpressionsanalysen von Mutanten und Wildtypen unter Anwesenheit der spezifischen Antimykotika erlauben weiteren Detailaussagen zum Resistenzmechanismus. 3. Klinische und angewandte Aspekte: Biobank. Für die prospektive Evaluierung neuer Tests (generiert innerhalb der WP 1-3) muss das entsprechende klinische Material (Vollblut, Seren, BAL und PBMC) vorhanden sein; wir werden eine entsprechende Biobank etablieren, Proben archivieren und Tests für die klinische Anwendung evaluieren. Patienten mit nachgewiesener invasiver Aspergillose (entsprechend EORTC-Kriterien) und hämatologischen Grundkrankheiten stehen im Vordergrund. a) Analyse humaner Biomarker: Eine Quantifizierung von Zytokinen und Chemokinen aus Serum soll mittels TruCultureTM System bewertet werden; die Analyse vom Immunstatus bei invasiver Aspergillose steht im Vordergrund. b) Risikopatienten und genetische Prädisposition. Dieser Projektteil umfasst eine Multicenter-Studie mit dem Fokus von genetischen â epidemiologischen Untersuchungen. Neue molekular-genetische Analysen sollen Risikofaktoren für eine invasive Aspergillose identifizieren; wir werden humanes Probenmaterial zur exakten Analyse zur Verfügung stellen. Die Proben rekrutieren sich aus retrospektiven Studien und aus der geplanten prospektiven Studien innerhalb dieses Konsortiums.

Die WissenschaftlerInnen des Projektes AspBIOmics haben es sich zum Ziel gesetzt, die Diagnose der invasiven Aspergillose zu verbessern. Eine schnellere und zuverlässigere Diagnose soll erreicht werden durch den Nachweis des Erregers bzw. charakteristische Bestandteile des Erregers im Serum der PatientInnen und durch die Identifikation neuer freigesetzter Moleküle (z.B. Oberflächenbestandteile des Pilzes, Erbgut des Pilzes). Bei der invasiven Aspergillose handelt es sich um eine Pilzinfektion der Lunge, vor allem Menschen mit geschwächtem Immunsystem werden von dem Schimmelpilz Aspergillus infiziert. Nicht nur die Erkennung der Aspergillose stellt den behandelten Arzt vor Schwierigkeiten sondern auch die Therapie. Im Speziellen, können sich hier Probleme durch Azol-resistente Erreger ergeben. Daher haben wir unter anderem das Vorkommen und die Häufigkeit Azol-resistenter Aspergillen und deren klinische Relevanz im Mausmodell untersucht. Dieses Projekt hat uns ermöglicht, folgende wichtige Beiträge für das Verständnis von Pilzinfektionen zu generieren. Die präventiv eingesetzten Antimykotika haben zur Folge, dass invasive Aspergillosen abnehmen, jedoch andere Pilze an deren Stelle treten. Des Weiteren konnten wir feststellen, dass wenn PatientInnen eine entsprechende präventive Therapie erhalten, die Serumtestverfahren für den Erregernachweis nicht geeignet sind, da es zu falsch positiven Befunden kommen kann. Das Wissen darüber stellt eine neue Information dar. Das Vorkommen von Therapie-resistenten Aspergillen ist derzeit am Medizinischen Universitätsklinikum Innsbruck gering. Anhand der Zytokinmessungen konnten diverse charakteristische Blutwerte festgestellt werden, welche zukünftig die Früherkennung der Aspergillose bedeutend verbessern könnten. Azol-resistente Aspergillen zeigen im immunkompetenten Mausmodell keine erhöhte Virulenz.Die von uns gesammelten Daten und Ergebnisse stellen wichtige Erkenntnisse dar, welche auch Auswirkungen auf die Präventionsstrategien und die Patientenbehandlung haben werden.