Untersuchungen zur RNA Faltung und Chaperone Aktivität mittels NMR

Das beantragte Projekt zielt auf ein genaueres Verständnis des konformationellen Raumes von Ribonukleinsäuren (RNA) und auf die biologische Funktion einer bestimmten RNA-Faltung ab. Die Faltungslandschaft von RNA ist zerklüftet und neben dem globalen Minimum werden energetisch ähnliche sub-optimale, aber besetzte Faltungszustände beobachtet. Ribonukleinsäure können durch diese Eigenschaft der freien Energiehyperfläche in nicht-funktionellen Konformationen gefangen werden. In dem vorgestellten Projekt werden wir uns auf 2 Fragestellungen besonders fokussieren: (1) Wie funktionieren die Übergänge zwischen unterschiedlichen Faltungen von Riboswitch RNAs auf atomarer Basis? Wie können die unterschiedlichen Funktionen (Gen an, Gen aus) dadurch bewirkt werden? (2) Wie sehen die molekularen Mechanismen der Interaktionen zwischen RNA Chaperon Proteinen und einer falsch gefalteten RNA aus? Um diese Fragestellungen beantworten zu können, werden schnelle hoch auflösende NMR spektroskopische Methoden, die für Proteine etabliert sind, für RNA adaptiert. Damit können dann RNA Faltungswege, RNA-Ligand Wechselwirkungen und Ligand-induzierte Umfaltungen in Echtzeit beobachtet werden. Dadurch werden die Kinetik dieser Prozesse und transient-populierte Faltungsintermediate via NMR Spektroskopie detektierbar. Zusätzlich werden die jeweiligen stabilen Faltungen mittels Spinrelaxations- und H/D-Austausch-NMR Spektroskopie auf gering besetzte, sogenannte angeregte, Zustände im Gleichgewichtszustand untersucht. Mit Hilfe von ortsspezifischen 13C-Markierungen, die eine hohe spektrale Auflösung für große RNA Systeme (> 50 Nukleotide) garantieren, werden die modernen und zum Teil auch neuentwickelten NMR Methoden an biologisch relevanten RNAs, wie selbstinduzierten und Metabolit-geschaltenen RNA Schalter- sund einem RNA-RNA Chaperone System, angewendet.

In dem abgelaufenen Projekt konnte erfolgreich ein neuer Weg, der chemische, biologische und physikalische Methoden vereint, etabliert werden, der es ermöglicht die Funktion von Ribonukleinsäure mit bis dato nicht zugänglichen Informationen zu verstehen. Ribonukleinsäure ist der Desoxyribonukleinsäure, DNA, der Trägerin der Erbinformation, sehr ähnlich, aber während DNA, einer längerfristigen Speicherung der genetischen Informationen dient, fungiert die RNA als Übergangsspeicher. Dabei ist die RNA aber nicht nur eine reine Kopie ohne weitere Funktion, sondern kann wichtige Aufgaben in der Zelle ausführen. In den letzten Jahren trat das komplexe Regulations-Netzwerk aus RNA-Molekülen und Proteinen aus dem Schatten des großen Bruders DNA hervor und ist nun Mittelpunkt vieler Forschungszweige. RNAs bestehen aus kleinen Bausteinen, den sogenannten Ribonukleotiden, und bilden lange Ketten, die in einem sogenannten Prozess der Faltung unerwartet-komplexe Gebilde bilden, um ihrer biologischen Aufgabe nachkommen zu können. Allerdings waren die zu Grunde liegenden Mechanismen dieser Faltungsprozesse wenig bekannt oder gar unbekannt. Mit Hilfe eines multidisziplinären Ansatzes, der organisch-chemische Synthese mit biochemischen und physikalischen Methoden kombiniert, konnten die Projektpartner einen experimentellen Rahmen schaffen, der es nun ermöglicht Momentaufnahmen von RNA Umfaltungs-Prozessen mit einer atomaren Auflösung mittels Kernresonanzspektroskopie (NMR) zu machen.