Betv1 spezifische Immunantwort in allergikern und Gesunden

Im Schrödinger ProjektJ 2107-MED wollen wir Betv1 (Betula verrucosa 1) spezifische Immunantworten in gesunden Individuen und allergischen Patienten vergleichen. Im ersten Jahr führten wir serologische Untersuchungen durch, studierten die Immunohistopathologie von palatinen Tonsillen, und machten durchflußzytometrische Analysen. Allergiker als auch gesunde Individuen haben nachweislich spezifische Immunglobuline im Serum, Betv1 spezifische Plasma Zellen in den Tonsillen sind aber nur In Allergikern histologisch nachweisbar, sogar außerhalb der Pollen-Saison. Es ist uns erstmals der Nachweis von Betv1 spezifischen Plasma Zellen in histologischen Schnitten und somit eine genaue Aussage über die Lokalisation dieser Zellen gelungen. Diese spezifischen Plasma Zellen können einerseits Betv1 spezifische Antikörper sezernieren, haben aber andererseits auch ein mit spezifischen Antikörpern dicht gepacktes Zytoplasma, welches man mit Fluorochrom-markiertem, rekombinanten Betv1 nachweisen kann. In Tonsillen von gesunden Individuen sind diese Plasma Zellen nicht vorhanden, obwohl auch gesunde Individuen wiederholten Kontakt mit dem Betv1 Protein haben. Man vermutet, dass das Milieu in den Tonsillen der Allergiker als ,,Überlebensnische" für wiederholt aktivierte Plasma Zellen fungiert. IgE positive B Zellen konnten auch histologisch nachgewiesen werden. Sie liegen perifollikulär außerhalb der Keimzentren und der Mantel Zone. Morphologisch sind diese B Zellen Plasma Zellen mit einem randständigen Kern. Die Anzahl der IgE positiven Plasma Zellen in allergischen Patienten ist höher als in den gesunden Kontrollen. Durchflußzytometrische Analysen wurden durchgeführt, um aus frischen Tonsillen-Material Betv1 spezifische 8 Zellen zu isolieren. Betv1 spezifische B Zellen konnten auch im peripheren Blut von allergischen Patienten als auch in gesunden Individuen isoliert werden. Dazu entwickelten wir eine Methode mittels derer wir das rekombinante Protein an Fluorochrome koppelten um dann daran bindende B Zellen zu detektieren. Betvl spezifische Zellen wurden für weitere molekularbiologische Untersuchungen auf Einzelzell- Niveau sortiert. Im zweiten Jahr des Projekts wollen wir das Betv1 spezifische Antikörper Repertoire der Einzelzellen molekularbiologisch analysieren und die spezifischen variablen Regionen der schweren (VH) und leichten (VL) Antikörper Ketten untersuchen. Wir wollen klären, welche VH/ VL Gensegmente für die Bildung der spezifischen Antikörper in allergischen Patienten und gesunden Individuen herangezogen werden. Wir planen die Betv1 spezifischen VH und VL Ketten in Phagemide zu klonieren, um sie als Fab Fragmente auf der Oberfläche von Phagen zu exprimieren. Das würde uns ermöglichen, die Affinitäten der einzelnen Fab Fragmente mittels Oberflächen Resonanz Technologie zu messen. Wir können die Frage klären, ob Betv1 Allergiker Antikörper mit unterschiedlicher Affinität produzieren. Weiters können wir dann beantworten, ob es sich um eine mono- oder polyklonale Immunantwort