Funktionelle Untersuchung von RAF Mutationen

Die Familie der RAF Proto-Onkogene, bestehend aus A-RAF, B-RAF und C-RAF, bildet den Eingang zum "mitogen activated protein kinase (MAPK)" Pfad, einer Signaltransduktionskaskade die hauptsächlich mitogene und anti-apoptotische Signale von der Zellmembran zu intrazellulären Effektorproteinen weiterleitet. Die Verbindung von Mutationen, welche bisher in B-RAF und C-RAF beschrieben wurden, zur Entstehung von bösartigen Erkrankungen gilt mittlerweile als gesichert. Die meisten der derzeit bekannten Mutanten verursachen eine konstitutive Aktivierung des MAPK Pfades, was wiederum zu der Annahme geführt hat, dass ihre onkogenen Effekte über die Aktivierung dieser Kaskade weitergeleitet werden. Diese simplifizierende Hypothese wird jedoch durch kürzlich entdeckte aktivierende B-RAF Keimbahnmutationen in Cardio Facio Cutanen Syndrom (CFC), einer Erbkrankheit ohne Prädisposition zu Malignomen, sowie durch die Entdeckung einer nicht aktivierenden onkogenen Keimbahnmutation in C-RAF durch unsere eigene Arbeitsgruppe in Frage gestellt. Wir postulieren hier, dass bestimmte RAF Mutationen die Bildung von verschiedenen Proteinkomplexen induzieren, und in weiterer Folge ihre onkogenen bzw. nicht onkogenen Eigenschaften über unterschiedliche Effektorproteine und -kaskaden weitergeleitet werden. Die Möglichkeit einer solchen, MAPK unabhängigen Signalweiterleitung konnte bereits bei der Beeinflussung der Apoptose durch C-RAF gezeigt werden. Darüber hinaus zeigen preliminäre Ergebnisse in PC12 Zellen, dass unterschiedliche extrazelluläre Stimuli zur Bildung von markant unterschiedlichen B-RAF Proteinkomplexen führen. Ziel dieser Studie ist es, Proteinkomplexe die spezifisch durch onkogene bzw. nicht onkogene RAF Mutationen induziert werden, zu identifizieren. Dafür werden wir zu Beginn Proteinkomplexe, die durch ein repräsentatives Set aus onkogenen und nicht onkogenen RAF Mutationen induziert werden, mittels quantitative proteomics identifizieren und vergleichen. In weiterer Folge werden wir mit diesen Proteinkomplexen ein sogenanntes pathway mapping durchführen, bei dem wir die spezifischen Effektorproteinkaskaden, die durch onkogene bzw. nicht onkogene RAF Mutanten verwendet werden, identifizieren können. Ein weiteres Ziel ist es, die Rolle von RAF Homo- und Heterodimerisierung bei physiologischer und pathologischer zellulärer Signaltransduktion aufzuklären. Solche RAF Heterodimere, deren wichtige biologische Funktion erst kürzlich vom Gastlabor bewiesen wurde, können einerseits unter physiologischen Bedingungen auftreten, können andererseits aber auch durch onkogene und wahrscheinlich auch nicht onkogene RAF Mutationen hervorgerufen werden. Wiederum werden wir Proteinkomplexe, die sich vor bzw. nach RAF Homo- und Heterodimerisierung bilden, mittels quantitative proteomics vergleichen und danach mit diesen ein pathway mapping durchführen, bei dem wir Effektorproteine und -kaskaden die spezifisch für RAF Homo- und Heterodimere sind, identifizieren werden.