Mutation der B. circulans Xylanase in eine Glycosynthase

Seit Oligosaccharide als wirksame Agenzien für therapeutische Anwendungen erkannt wurden, hat die Synthese dieser Biomoleküle für die pharmazeutische Industrie zunehmend an Bedeutung gewonnen. Aufgrund der komplexen Struktur von Oligosacchariden, erweist sich jedoch die klassische chemische Synthese als schwierig und umständlich. Daher sind Konzepte, welche die zielgerichtete Derivatisierung von Zuckerresten und folglich die Optimierung ihrer möglichen Anwendung beinhalten, noch immer bedingt realisierbar. Der Einsatz von Enzymen zur Produktion von Oligosacchariden in größeren Mengen stellt diesbezüglich eine viel versprechende Alternative zur mühsamen und aufwendigen synthetischen Chemie dar. Diese Vorgehensweise wurde kürzlich durch Withers und Kollegen in bahnbrechenden Studien vorangetrieben, indem sie für diesen Zweck Glycosidasen mutiert haben. Künftige Schritte umfassen nun die Modifikation der Aktivität gut bekannter Enzyme und im speziellen die Herausforderung, entwickelte Mutanten mit veränderten Eigenschaften, bezüglich ihrer Substratbindung und enzymatischen Aktivitäten zu überprüfen und zu selektieren. Die Xylanase aus Bacillus circulans gehört, sowohl auf struktureller als auch auf funktioneller Ebene, zu einer der am besten charakterisierten Glycosidasen. Aufgrund der kleinen Molekülmasse (20 kDa) ist dieses Enzym besonders gut geeignet, die katalytischen Eigenschaften mittels zielgerichteter Mutagenese (directed evolution) kombiniert mit der Phagen-Display Technologie hinreichend zu verändern. Ziel dieses Projekts ist, die Xylanase aus Bacillus circulans so zu mutieren, dass Enzymvarianten erzeugt werden, die modifizierte Zuckersubstrate (Donator) binden und diese Kohlenhydratreste auf Akzeptoren transglykosilieren, welche vom ursprünglich unveränderten Enzym nicht angenommen worden wären. Auswahl und Selektion dieser neu entwickelten Enzyme erfolgt durch Zucker-Inhibitoren, die Teil eines modifizierten Phagen-Display Verfahren sind. Computer-Modelle, basierend auf bereits bekannten 3-dimensionalen Strukturdaten der nativen Xylanase, werden für die primäre strukturelle Analyse mutierter Enzyme mit neuartigen Eigenschaften verwendet. Detailliertere Informationen über die molekularen Interaktionen werden über bestehende Kooperationen mit Arbeitsgruppen, die auf die Bestimmung von Proteinstrukturen mit Hilfe von Röntgen-Kristallographie- oder Kernspinresonanz- (NMR) Technologien spezialisiert sind, gewonnen. Von der Durchführung dieses Projekts erhoffe ich mir, bessere Einsichten in die molekularen Mechanismen von Glycosidasen und Glycosynthasen zu erhalten. Diese Erkenntnisse könnten sowohl den wissenschaftlichen Fortschritt in der Kohlenhydrat-Chemie als auch in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung fördern.