Charakterisierung zytoplasmatischer Ago2-komplex-Komponenten

RNA-interferenz ist ein erst kürzlich entdeckter Weg zur negativen Genregulation, die durch durch kleine RNA- moleküle vermittelt wird. Diese entstammen entweder zelleigenen microRNA-Vorläufern, langen doppelsträngigen RNAs, oder aber sind viralen oder synthetischen Ursprungs. Eine kurze prozessierte einzelsträngige RNA, der sogenannte Leitstrang, wird in bestimmte Ribonukleoprotein-komplexe, die "RNA-induced silencing complexes" (RISCs) eingebaut, welche komplementäre Boten-RNAs als spezifische Zielsequenzen erkennen. Diese werden daraufhin entweder abgebaut oder deren Translation in Protein wird unterbunden. Essentielle Bestandteile von RISC sind die Mitglieder der Argonauten-Proteinfamilie. Es sind acht verschiedene dieser Proteine im Menschen bekannt, wovon aber nur eines, Argonaute 2 (Ago2 oder eIF2C2), im Stande ist, die Ziel-Boten-RNA in zwei Teile zu schneiden, ein Prozess der "Slicing" genannt wird. Studien haben gezeigt, dass Ago2 mit Dicer interagiert, einem RNase III enzym, das microRNA-Vorläufer und lange Doppelstrang-RNA in kurze Stücke von ca. 21 Nukleotiden prozessiert. Weiters ist auch das HIV-1 TAR RNA-bindende Protein (TRBP), welches von HIV zur viralen Vermehrung ausgenutzt wird, Bestandteil dieses minimalen RISC. Aber der natürliche vorkommende größere "holo" RISC enthält noch zahlreiche andere Proteine, die bislang noch nicht ausreichend erforscht sind. Im vorgeschlagenen Projekt wollen wir Ago2-enthaltende Proteinkomplexe aus zytoplasmatischen Zellextrakten herausreinigen, in einzelnen Komponenten auftrennen und diese mit Hilfe der Massenspektroskopie identifizieren. Nach Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenzen können die Proteine rekombinant produziert, und Antikörper gegen sie hergestellt werden. Diese werden im Anschluss zur Bestätigung der Interaktionen mittels Ko- immunopräzipitation, zellulärer Ko-lokalisierung und Western Blotanalyse von Größenfraktionen verwendet. Verifizierte Komponenten werden weiters auf ihre Wichtigkeit in der RNA-interferenz untersucht, indem die Effizienz der miRNA und siRNA-vermittelten Genregulation nach dem Ausschalten eines entsprechenden Kandidatenproteins bestimmt wird. Ebenso werden auch die RNA-komponenten von Ago2-komplexen isoliert, kloniert und sequenziert. Durch die genaue Analyse der einzelnen Komponenten der Ago2-komplexe und deren Wechselwirkungen sollten wir in der Lage sein, ein verbessertes Modell über die RISC-funktion aufzustellen, welches wiederum zum Entwurf effizienterer RNAi-strategien von Nutzen sein könnte.