Struktur einer Oligosaccharyl: S-Schichtprotein transferase

Glykoproteine sind in der Natur weit verbreitet und spielen in allen Organismen eine wichtige Rolle bei vielen biochemischen Vorgängen, z. B.: bei Erkennungsreaktionen durch das Immunsystem, Adhäsionsvorgängen und bei Transportvorgängen. Deshalb bietet die Herstellung von maßgeschneiderten Glykoproteinen die Möglichkeit komplexe biologische Systeme zu beeinflussen und zu kontrollieren. Voraussetzung dafür ist ein genaues Verständnis aller Prozesse, die an der Proteinglykosylierung beteiligt sind. S-Schichtglykoproteine haben die Fähigkeit zur Selbstassemblierung und ermöglichen dadurch die Präsentation von Glykanen in regelmäßiger Anordnung, in hoher Dichte und mit Nanometerpräzision. An der Glykanbiosynthese des S-Schichtglykoproteins des Modellorganismus Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a sind mehrere Glykosyltransferasen und ein ABC-Transporter beteiligt. Das eigentliche Schlüsselenzym für die Glykanbiosynthese, und daher auch für das "Carbohydrate Engineering", ist die Oligosaccharyltransferase WsaB, ein Membranprotein, das im letzten Schritt der Biosynthese die Glykankette auf das S-Schichtprotein SgsE überträgt. Im vorliegenden Projekt soll (i) die Kristallstruktur der Oligosaccharyltransferase WsaB von G. stearothermophilus NRS 2004/3a und verkürzter Formen davon mit Hilfe von Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden, (ii) strukturelle Einblicke in den Reaktionsmechanismus von WsaB in Bezug auf die Substratspezifität und konservierter Aminosäuren in der katalytischen Region durch Cokristallisationsversuche und "site-directed mutagenesis" erhalten werden und (iii) die Wechselwirkung von WsaB mit den Aminosäuren in der Umgebung der Glykosylierungsstellen von SgsE ermittelt werden. Obwohl in den letzten Jahren viele Strukturen von löslichen Proteinen publiziert worden sind, sind nur etwa 200 Strukturen von Membranproteinen bekannt. Die Kristallographie von Membranproteinen stellt eine große technische Herausforderung dar, und zwar sowohl hinsichtlich der Expression und Reinigung der Proteine, als auch in Bezug auf deren nachfolgende Kristallisation. Diese Experimente sollen im Labor von Prof. James Naismith an der Universität von St Andrews in Großbritannien durchgeführt werden. Dieses Labor hat sich auf die Röntgenstrukturanalyse von Membranproteinen, und speziell von Membranproteinen, die an Glykanbiosynthesen beteiligt sind, spezialisiert. Daher verfügt dieses Labor über ein fundiertes Wissen über Klonierung, Expression, Reinigung und Kristallisation von Membranproteinen. Das Verständnis der Funktionalität der katalytischen Domänen ermöglicht es diese für das angestrebte "Carbohydrate Engineering" hinsichtlich der Substratspezifität zu verändern. Dadurch kann die Oligosaccharyltransferase für das jeweilige zu übertragende Glykan maßgeschneidert werden, und somit eine Schlüsselrolle für das Design von "intelligenten" S-Schichtglykoproteinen spielen.