Quantitative Proteomik am Lck Signaltransduktionskomplex

Trotz jahrelanger Anstrengungen auf dem Gebiet der Signaltransduktion von T-Zellen gibt es noch immer kein klares Bild wie Stimulierung von T-Zellen über den T-Zellrezeptor zur Aktivierung der zentralen Proteintyrosinkinase Lck führt. Überraschend wenig ist bekannt über die posttranslationellen Modifikationen, welche zur Aktivierung von Lck führen. Im Gegensatz zur bisher vorherrschenden Lehrmeinung, kristallisiert sich z.B. momentan heraus, dass die Dephosphorylierung des regulatorischen C-terminus von Lck keine kritische Rolle während der T-Zellaktivierung spielt. Es scheint viel eher, dass hochaffine Adaptermoleküle als Brücke zum T- Zellrezeptor fungieren, an Lck herantreten, seine Struktur öffnen und damit die Kinaseaktivität stimulieren. Diese neunen Konzepte könnten einen Paradigmenwechsel einläuten und verdeutlichen die Wichtigkeit einer globalen und unvoreingenommenen Neuuntersuchung des regulatorischen Komplexes um Lck. Das Ziel des vorgeschlagenen Projektes ist eine umfassende und quantitative Beschreibung des dynamischen Phosphoproteoms und Interaktoms von Lck während der T-Zellaktivierung und damit einhergehend eine neue Perspektive auf regulatorische Mechanismen der Signalstärke am T-Zellrezeptor. Mangels hochempfindlicher Instrumentierung waren solche Studien bisher unmöglich. Im vorgeschlagenen Projekt werden die neusten massenspektrometrischen Methoden und Instrumente zum Einsatz kommen, um eine zeitaufgelöste Karte der Phosphorylierungsstellen von Lck zu erhalten. Wir werden neu entdeckte, relevante Phosphorylierungsstellen mittels biochemischer und funktioneller Ansätze charakterisieren. Den zweiten Teil den Projekts werden wir einer genauen Identifizierung von Interaktionspartnern von Lck widmen. Dazu wird ein hochaffiner Epitop-Tag an Lck fusioniert, um die Inkubationszeiten während der Präzipitation kurz zu halten und auch instabile Komplexe zu isolieren. Die T-Zellstimulation wird so physiologisch als möglich, mittels MHC-Peptidkomplexen, durchgeführt. Neu identifizierte Interaktionspartner werden eingehend charakterisiert und den einzelnen Subdomänen von Lck zugewiesen und andere Moleküle des Lck-Interaktoms werden ebenfalls mit einem Epitop-Tag versehen um die Interaktionskarte von Lck zu verfeinern und zu vergrößern. Das Projekt zielt auf die erste quantitative Beschreibung des Signalnetzwerks von Lck in T-Zellen ab und könnte einen wertvollen Beitrag zu unserem Verständnis von T-Zellbiologie und Aktivierung von Src-Kinasen leisten. Neue regulatorische Mechanismen von Lck können auch lohnende therapeutische Ansatzpunkte darstellen.