Entwicklung von funktionalisierten Crosslinking Reagenzien

Die Untersuchung von biologischen Interaktionswegen wie zum Beispiel Signalkaskaden wird durch fortwährende methodische und technologische Fortschritte erleichtert. Heute stellen Technologien der Proteomik in Kombination mit der Massenspektrometrie Werkzeuge zur Verfügung, die das in die Tiefe gehende Identifizieren von Proteinen in lebenden Systemen ermöglichen. Weiters wurden Technologien verfügbar gemacht, die Informationen, die über das reine Katalogisieren von Proteinen hinausgehen, wie etwa die Lokalisierung post-translationaler Modifikationen oder die Analyse von quantitativen Unterschieden in der Proteinexpression. All diese Methoden zielen auf solubilisierte, dissoziierte und denaturierte Proteine ab. Weil die meisten biologischen Prozesse jedoch nicht von einzelnen Proteinen ausgeführt werden, sondern von Proteinen, die in Proteinkomplexen mit anderen Protein interagieren, fehlt vielen Datensätzen in der Proteomik die relevante Information. Proteinkomplexe fügen sich dann mit anderen Komplexen zu einer höheren Ebene von Interaktionsnetzwerken zusammen. Obwohl in letzter Zeit bedeutende Fortschritte zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und Proteinkomplexen erzielt worden sind, besteht weiterhin ein dringender Bedarf an weiteren Entwicklungen, die eine umfassende Analyse von Proteinkomplexen und Netzwerken in lebenden Systemen ermöglichen. Insbesondere ist es notwendig, die tatsächliche Zusammensetzung von Proteinkomplexen in der Zelle, die dynamischen Veränderungen ihrer Zusammensetzung als Reaktion auf Veränderungen im Haushalt der Zelle sowie die Topologie dieser Komplexe und der wechselwirkenden Regionen der einzelnen Untereinheiten zu bestimmen. Hier schlagen wir die Entwicklung einer neuen Technik zur Studie der Topologie von Proteinkomplexen auf systemweiter Ebene vor. Diese basiert auf einer neuen Gruppe von funktionalisierten Crosslinking-Reagenzien und der massenspektrometrischen Analyse von mit ihrer Hilfe quervernetzter Peptide. Die Crosslinker werden Affinitäts-Tags enthalten, die es ermöglichen, markierte Peptide selektiv aus komplexen Peptidmischungen, die vom Verdau von vernetzten biologischen Proben stammen, zu isolieren. Der Einsatz dieser optimierten Crosslinker wird mit der Verwendung von fortschrittlicher massenspektrometrischer Analytik und leistungsfähiger bioinformatischer Werkzeuge, die nur im Labor des Gastgebers vorhanden sind, verbunden werden, und es wird erwartet, daß dadurch eine neue Ebene in der Organisation von Proteinkomplexen untersucht werden kann. Als eine der möglichen Anwendungen dieser integrierten chemisch - massenspektrometrisch - bioinformatischen Methode werden wir die Interaktionen von Proteinkinasen, die in Zusammenhang mit Krebs stehen, und die Signaltransduktionswege diese Proteinfamilie näher untersuchen.