Inaktivierung humaner Myeloperoxidase durch Oxidationsmittel und Suizidsubstrate

Myeloperoxidase (MPO) kommt in grossen Mengen in neutrophilen Leukozyten vor. Das Enzym produziert Oxidationsmittel mit starker antimikrobieller Wirkung und spielt dadurch eine wichtige Rolle in der unspezifischen Immunabwehr. Mit Hilfe von Wasserstoffperoxid (H2 O2 ) oxidiert MPO Chlorid und Bromid zu den entsprechenden Säuren (HOCl und HOBr). Die von MPO produzierten Oxidationsmittel sind jedoch auch an der Entstehung von Gewebeschäden im Verlauf vieler Entzündungskrankheiten beteiligt. Aus diesem Grund besteht grosses Interesse an der Entwicklung von therapeutisch wirksamen MPO Inhibitoren. Es ist bekannt, dass MPO durch verschiedenste Oxidationsmittel, u.a. auch durch seine Substrate bzw. Reaktionsprodukte H2 O2 und HOCl, inaktiviert wird. Es ist anzunehmen, dass Halogenierungs- und Oxidationsreaktionen die Modifikation von spezifischen Aminosäureresten und der prosthetischen Häm-Gruppe bewirken und dadurch in der Folge das Enzym inaktivieren. Eine noch nicht veröffentlichte Arbeit zeigt, dass oxidativ modifizierte MPO noch bakterizide Wirkung zeigt. Die entsprechenden Enzymmodifikationen wurden bis jetzt allerding noch nicht näher untersucht. Derartige Modifikationen könnten als Biomarker eingesetzt werden, um die Rolle von MPO im Verlauf bestimmter Krankheiten besser und vor allem direkt abzuschätzen. Weiters wurden in der Literatur vielversprechende, therapeutisch wirksame, irreversible MPO-Inhibitoren beschrieben. Die Mechanismen und Modifikationen die zur irreversiblen Inaktivierung von MPO führen, sind jedoch gänzlich unbekannt. Ziel dieses Forschungsantrags ist die Analyse der Mechanismen und Orte der Enzymmodifikationen, die zur Inaktivierung von MPO nach der Stimulation von neutrophilen Leukozyten führen, bzw. wenn das Protein den entsprechenden Oxidationsmitteln ausgesetzt wird. Weiters sollen die Mechanismen und strukturellen Modifikationen nach Reaktion von MPO mit Suizidsubstraten ermittelt werden. Die daduch gewonnenen Informationen können zum Design von höchstspezifischen MPO-Inhibitoren sowie zur Entwicklung von spezifischen Biomarkern zur Bestimmung von oxidierter bzw. inaktivierter MPO verwendet werden. Aus neutrophilen Leukozyten gereinigte dimere MPO wird zu diesem Zweck mit den relevanten Oxidationsmitteln unter verschiedenen, genau definierten Bedingungen inkubiert. Die Zusammenhänge zwischen Modifikationen am Enzym und Enzyminaktivierung werden mit Hilfe von kinetischen Untersuchungen (steady-state und pre-steady state Kinetik) in Kombination mit Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert. Weiters werden die Auswirkungen derartiger Proteinmodifikationen auf die Halogenierungs- und Peroxdiaseaktivität von MPO untersucht.