Ein PP2A-abhängiger Signalweg reguliert Quieszenz in G2/M

Die Quieszenz, neben Seneszenz und Differenzierung, ist einer von drei möglichen Zuständen, in welchen sich die Zelle nicht weiter teilen kann. Sie ist durch ihre Reversibilität, sowie ein einzigartiges, während anderen Varianten des Zellzyklus-Arrests nicht vorhandenes Genexpressions-Muster charakterisiert. Die wichtigsten molekularen Regulatoren, die am Eintritt in die Quieszenz und an deren Aufrechterhaltung beteiligt sind, sind die "Pocket" - Proteine: das Retinoblastoma - Protein und seine zwei nahen Verwandten p107 und p130. Während lange angenommen wurde, dass diese Regulatoren während der G1 Phase des Zellzyklus wirken, zeigen spannende, unveröffentlichte, in diesem Antrag beschriebene Daten, dass ein wesentlicher Entscheidungspunkt für die Quieszenz-Entwicklung in der G2 Phase des Zellzyklus aktiv zu sein scheint. Bei diesem in G2 wirkenden Entscheidungsprozeß dürfte eine der wichtigsten zellulären Serin-Threonin Phosphatasen, PP2A, mitwirken. Inhibierung von PP2A spezifisch in G2 führt zur Freisetzung von "Pocket" - Proteinen aus der zellulären Chromatinfraktion und Resistenz der Zellen gegenüber Quieszenz-induzierenden Signalen in der darauf folgenden G1 Phase. Es wurde gezeigt, dass der spezifische, für diese Aktivität verantwortliche PP2A Komplex die B56 Subeinheit enthält. Interessanterweise gab es bereits zuvor Hinweise, dass die gleiche Subeinheit bei der Transformation von Säugetierzellen eine Rolle spielt, wenn sie funktionell inhibiert wird. Die genauen molekularen Mechanismen hinter dem G2-zentrierten PP2A-abhängigen Quieszenz-Entscheidungspunkt sind noch unklar. Der vorliegende Projektantrag soll die molekularen Regulatoren, die am G2 Quieszenz-Entscheidungsprozess beteiligt sind, aufklären. Zudem sollen die funktionellen Wechselwirkungen dieser mutmaßlichen Regulatoren mit PP2A untersucht werden. Zuerst soll die Beteiligung des erst kürzlich beschriebenen p130/DREAM-Komplexes, welcher p130, E2F4 und die Säugetier-Homologen des C. elegans synMUVB Komplex enthält, am G2-zentrierten Quieszenz-Pfad geprüft werden. Es wurde bereits gezeigt, dass der p130/DREAM-Komplex für die Aufrechterhaltung der Quieszenz in Zellen essentiell ist. Ich möchte untersuchen, ob PP2A den Aufbau (Assembly) oder Abbau (Disassembly) des Komplexes beeinflussen kann, und ob das durch Dephosphorylierung bestimmter DREAM-Subeinheiten während der G2 Phase passiert. Schließlich soll getestet werden, ob ein fehlerhaftes Aufbauen des Komplexes die Zellen resistent gegenüber Wachstumsfaktor-Entzug und anschließender Quieszenz- Entwicklung macht. Um mehr über jene Proteine zu erfahren, die am G2-zentrierten Quieszenz-Pfad beteiligt sind, möchte ich parallel dazu einen Screen durchführen. Dafür soll eine lentivirale shRNA Bibliothek und ein kürzlich beschriebenes System Fluoreszenz-markierter Proteine verwendet werden, welches das spezifische Erkennen von S/G2 Zellen gegenüber G1/G0 Zellen erlaubt. So möchte ich zunächst Proteine identifizieren soll, welche essentiell für den Eintritt in die Quieszenz sind, um dann ihre genaue Rolle beim Quieszenz-Eintritt und/oder deren Aufrechterhaltung zu klären. Schließlich soll ihre potenzielle Beteiligung am PP2A-abhängigen G2-zentrierten Quieszenz-Pfad überprüft werden.