Validierung von massiv-parallel Target Anreicherungsmethode

Die Probenvorbereitung und Targetanreicherung sind die Schlüsselschritte der mikrobiellen Diagnostik. Dennoch wurden deren Entwicklung und Optimierung bis vor kurzen vernachlässigt. Dass die Forschung bisher überwiegend auf die Detektionsmethoden und Assays fokussiert war, liegt sicher daran, dass schnelleren und greifbaren Ergebnissen erzielbar sind. Die großen Herausforderungen verbunden mit der Probenvorbereitung sind die Diversität der Probenmatrizes (Wasser, Lebensmittel, Blut, Boden, Mist, Körperflüssigkeiten und Gewebe), die Diversität der zu detektierenden Organismen (Bakterien, Viren, Pilze und Protozoen) und die gewünschte Methodeneffizienz und Reproduzierbarkeit (Detektionslimit, spezifische Targetanreicherung, Beibehaltung von ursprünglichen Gegebenheiten in der Probe). All das lässt keine einfachen oder universellen Lösungen erwarten. Das Ziel, der in diesem Antrag vorgeschlagene Forschung ist die Entwicklung einer "massiv-parallel" Targetanreicherungsmethode. Mittels spezifischen langen Oligonukleotidsonden ("baits") werden verschiedene Antibiotikaresistenz-Gene angereichert. Die Anreicherungseffizienz und die Abundanz der Gene wird mittels Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden ermittelt. Abschließend wird die Targetanreicherungsmethode in Kombination mit einem Schnelltest (60 Minuten Probe zu Ergebniss) evaluiert. Mittels moderner in-silico Methoden werden 25.000 bis 100.000 Oligonukleotidsonden ("baits") (120 Nukleotide) für die Anreicherung von insgesamt 200 bis 500 verschiedene funktionelle Gene entwickelt. Dabei werden drei Systeme von verschiedener Komplexität verwendet (Antibiotikaresistenzgene, Virulenzgene und E.coli-spezifische Gene). Die relevanten Proben für die Systemvalidierung (z.B. Lebensmittel oder Abwasser) wurden bereits gesammelt und werden zur Verfügung gestellt. Die Datenauswertung wird mit zwei verschiedene Detektionssystemen erfolgen und verglichen; der 454 Sequenzierung und einem "point-of-care mobile" Detektionssystem. Die in diesem Projekt etablierten experimentellen Methoden werden Anwendung in funktionellen Metagenomstudien als auch in der multiplexen Diagnostik finden.