MhyADH: Biokatalytische und strukturelle Charakterisierung

Das Enzym MhyADH (Michael Hydratase/Alkohol Dehydrogenase) [1] [2] ist eine kürzlich entdeckte Hydratase/Alkohol Dehydrogenase, die ihren Ursprung im Cyclohexanol abbauenden Bakterium Alicycliphilus denitrificans DSMZ 14773 (isoliert aus Klärschlamm) hat. Die Hydratase Aktivität von MhyADH katalysiert die enantioselektive Adddition von Wasser an alpha, beta-ungesättigte Carbonylverbindungen (natürliche Reaktion: 2- Cyclohexenon zu 3-Hydroxycyclohexanon). Diese Art von Reaktion ist mit einfachen chemischen Methoden nicht durchführbar. Dies spiegelt sich in der Tatsache wider, dass bis jetzt nur wenige nicht-enzymatische Methoden publiziert wurden. [3] [4] [5] Weiters katalysiert die ADH Aktivität anschließend die Umsetzung von 3- Hydroxycyclohexanon zu 1,3-Cyclohexanedion. MhyADH besteht aus drei Untereinheiten, wobei jede Untereinheit einen unterschiedlichen Co-Faktor besitzt. Die größte Untereinheit beinhaltet Molybdopterin, die mittlere Untereinheit eine FAD Einheit und die kleinste Untereinheit einen [2Fe-2S] Cluster. [1] [2] Durch das eingereichte Projekt soll das Enzym MhyADH in biokatalytischer und struktureller Hinsicht genauer charakterisiert werden. Hierbei soll das Substratspektrum bestimmt und die Enzymstruktur aufgeklärt werden um eine bessere Einsicht in den Mechanismus der Michael-Addition von Wasser zu erhalten. Weiters wird versucht werden das Enzym heterolog zu expremieren, wobei zum Beispiel E. coli als Expressionssystem verwendet wird. Die hier beschriebene Arbeit wird an der Technischen Universität von Delft unter der Leitung von Dr. Ulf Hanefeld (Arbeitsgruppe Biokatalyse und Organische Chemie) durchgeführt werden. [1] Jin J, Straathof AJJ, Pinske MWH, Hanefeld U: Purification, characterization, and cloning of a bifunctional molybdoenzyme with hydratase and alcohol dehydrogenase activity. Appl. Microbiol. Biorechnol 2011, 86:1831- 1840. [2] Jin J, Osakam PC, Karmee SK, Straathof AJJ, Hanefeld U: MhyADH catalysed Michael addition of water and in situ oxidation. Chem. Commun. 2010, 46:8588-8590. [3] Boersma AJ, Coquiere D, Geerdink D, Rosati F, Feringa BL, Roelfes G: Catalytic enantioselective syn hydration of enones in water using a DNA-based catalyst. Nat. Chem. 2010, 2:911-995. [4] Feng X, Yun J: Catalytic enantioselective boron conjugate addition to cyclic carbonyl compounds: a new approach to cyclic beta-hydroxy carbonyls. Chem. Comm. 2009:6577-6579. [5] Hartmann E, Vyasa DJ, Oestreich M: Enantioselective formal hydration of a,b-unsaturated acceptors: asymmetric conjugate addition of silicon and boron nucleophiles. Chem. Commun. 2011, 47:7917-7932

Ziel des Projektes war die Untersuchung eines Enzyms (Michael Hydratase Alkohol Dehydrogenase) für den Einsatz bei der Synthese von pharmazeutischen Bausteinen (z.B. sekundäre Alkohole). Frühere Publikationen beschreiben das Enzym als bi- funktionell, das heißt es ist in der Lage zwei unterschiedliche Reaktionen in diesem Fall eine Hydratisierung (Anlagerung von Wasser an Doppelbindungen) und eine Dehydrogenierung zu katalysieren. Der Fokus lag auf der Hydratisierungsreaktion, da hierfür Wasser als Substrat eingesetzt wird und dies eine sehr effiziente Synthesevariante darstellt. Nach anfänglichen Schwierigkeiten die bereits publizierten Daten zur enzymatischen Aktivität zu reproduzieren, stellte sich heraus, dass die zu untersuchende Reaktion auch mit ganz einfachen Aminosäuren katalysiert werden kann und möglicherweise nicht wie beschrieben vom Enzym. Diese Beobachtung wurde zuvor noch nicht beschrieben und daher im Projekt als Alternative zur biokatalytischen Variante ausgebaut. Unter optimierten Bedingungen stellt die Reaktion eine sehr einfache Alternative zur Herstellung von sekundären Alkoholen dar. Die Schönheit liegt in der Einfachheit des Reaktionssystems. Da Wasser auch als Substrat fungiert, benötigt man neben dem Akzeptor-Substrat nur wässrigen Puffer und L-Lysin als Katalysator. Während der Studie wurden alle natürlichen Aminosäuren getestet und L-Lysin als die aktivste bestimmt. Aminosäuren sind sehr günstige und umweltfreundliche Katalysatoren, da sie in großen Mengen aus natürlichen Quellen gewonnen werden und sehr einfach zu entsorgen sind. Das entwickelte Reaktionssystem zur Hydratisierung von Doppelbindungen mit Aminosäuren als Katalysatoren stellt eine attraktive und einfache Alternative zu bereits bekannten Systemen dar. Der Vorteil liegt klar in der Einfachheit und Umweltfreundlichkeit der Reaktion.