Regulation und Rolle der NAD Biosynthese in alternder Hefe

Eine beträchtliche Zahl von Alterungsfaktoren in Backhefe (S.cerevisiae) weisen darauf hin, dass die Regulation des NAD Haushalts in Zellen einen starken Effekt auf die Lebensspanne von Hefe hat. Beispielsweise lässt sich die Aktivität der mit Langlebigkeit verknüpften Histon Deacetylase Sir2 durch das intrazelluläre Gleichgewicht zwischen NAD und NADH beeinflussen und durch Nikotinamid inhibieren. Kynurenin, ein Vorläufermolekül von NAD, wurde mit der Verlängerung der Lebensspanne von D.melanogaster and C.elegans in Zusammenhang gebracht. Zudem ist Kynurenin mit einer Reihe von alterungsbedingten Erkrankungen verknüpft. Trotz der starken Hinweise für den Zusammenhang von NAD Stoffwechsel und Altern sind die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen noch nicht bekannt. Während eines zweijährigen Postdoc Aufenthalts in der Gruppe von Dr. Markus Ralser (Cambridge Systems Biology, Centre, University of Cambridge) planen wir folgende wissenschaftliche Fragen zu adressieren: Wie wird die NAD Synthese in Hefe reguliert und welche Auswirkungen hat diese Regulation auf deren Lebensspanne? Dafür werden wir in einem System Biologie Ansatz die Stärken von systematischer Hefegenetik mit sensitiven analytischen LC-MS/MS (MRM) Methoden zur Bestimmung von Protein- und Metabolit-Profilen verbinden. Wir erwarten durch unsere Resultate ein detailliertes Verständnis für die Rolle der NAD Biosynthese während des Alterungsprozesses. Das erreichen wir 1) durch die Identifikation von Regulatoren des NAD Stoffwechsels in dem Satz an Genen mit bereits bekannten Alterungsphänotypen und 2) durch die Untersuchung der Effekte von an der NAD Synthese beteiligten Genen auf alternde Hefe.

Stoffwechsel bzw. Metabolismus ist zentraler Teil eines jeden lebenden Organismus. Tausende enzymatische Reaktionen laufen in Zellen ab um die Umwandlung von Nährstoffen in Energie und wichtige Bausteine der Zelle zu gewährleisten. Diese bilden zusammen das sogenannte Metabolische Netzwerk, bei dem es sich nicht um eine starre Struktur handelt, sondern um ein hochgradig flexibles und reguliertes Geflecht an Einzelreaktionen, das in der Lage ist schnell auf geänderten biosynthetischen Bedarf und auf unterschiedlichste externe Umwelteinflüsse zu reagieren. Obwohl es in den letzten Jahrzehnten gelungen ist viele Details über einzelne Enzyme zu erforschen, ist unser Wissen um die Regulation und das Zusammenwirken dieser Reaktionen in einem Organismus heute noch stark beschränkt. Diese Limitierung erschwerte Beispielsweise die Entwicklung von zielgerichteten therapeutischen Ansätzen die Krankheiten oder dem Alterungsprozess entgegenwirken sollten. Durch den Einsatz von modernsten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden sind wir in der Lage Stoffwechselveränderungen in der Zelle zu studieren, die als Folge einer gezielten Inaktivierung von potentiellen regulatorischen Genen entstehen. Die Quantifizierung der dadurch erzwungenen Rekonfigurierung des Stoffwechselnetzwerkes erlaubt es das regulatorische Potential der entsprechenden Gene zu erforschen. Im Zuge der Entwicklung der dafür benötigten LC-MS/MS Methoden machten wir eine unerwartete, jedoch aufregende Entdeckung: Unsere experimentelle Beobachtungen erlaubten den evolutionären Ursprung der Struktur des Stoffwechselnetzwerks während der Entstehung des Lebens besser zu verstehen. Wir entdeckten dass sich Zuckerphosphate, Substanzen welche die zentralen Stoffwechselwege Glykolyse und Pentosephosphatweg definieren, in Abwesenheit von Enzymen und bei moderaten Temperaturen (70C) ineinander umwandeln. Von besonderem Interesse war, dass sich die Umwandlungen unter Zugabe von Eisen(II) in diesem prebiotischen System in der gleichen Art und Weise vollzogen wie sie auch in lebenden Zellen zu beobachteten sind. Eisen ist ein häufiges Übergangsmetall und war vor 3.8 Milliarden Jahren während der Entstehung des Lebens in hohen Konzentrationen in den Urozeanen gelöst. Dieses nichtenzymatische Reaktionsnetzwerk zeigte sich hocheffizient und gibt die Topologie von Glykolyse und Pentosephosphatweg wieder. Zudem konnten wir eine pH und Eisen abhängige Aktivierung des Netzwerkes beobachten. Dies entspricht einer wichtige Eigenschaft moderner Stoffwechselnetzwerken, die Möglichkeit gewisse Subnetzwerke an- und abzuschalten. Ausgehend von diesen Beobachtungen konnten wir zudem darlegen, dass auch für den Krebs Zyklus ein nicht-enzymatisches Pendant existiert, das allerdings ein anderes chemisches Umfeld, basierend auf Sulfat Radikalen statt Eisen, erfordert. Zusammengefasst zeigen unsere Resultate, dass die zugrundeliegende Architektur moderner Stoffwechselnetzwerke möglicherweise maßgeblich durch physikochemische Eigenschaften der frühen Erde geprägte wurde. Einfache anorganische Moleküle, die häufig in Urozeanen zu finden waren, können als Katalysatoren dieser Reaktionssequenzen dienen und damit die Struktur des zentralen Kohlenstoffwechsels in modernen Organismen erzeugen. Folglich unterstützen unsere experimentellen Beobachtungen die Hypothese, dass die Entstehung der Struktur einiger der zentralsten Stoffwechselwege grundlegend durch bestehende prebiotische Reaktionskaskaden beeinflusst wurde und damit nicht das Resultat natürlicher Selektion während späteren Stadien der Evolution ist.