Änderung der Cofaktor Spezifität von Methyltransferasen

Die Übertragung von Methylgruppen ist ein essentieller Schritt, der in vielen Reaktionen jeder lebenden Zelle stattfindet. Diese Transformation wird von Methyltransferasen (MTasen) katalysiert. Alle MTasen benötigen Kofaktoren um ihre Funktion ausüben zu können, wobei S-Adenosyl-L-Methionin der am Häufigsten verwendete Kofaktor in biologischen Systemen ist. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben dem natürlichen SAM auch SAM-Analoga mit erweiterten Kohlenstoffketten, von DNA-C-MTasen sowie auch von C-MTasen die kleine Moleküle methylieren, als Kofaktoren akzeptiert werden. Dieser Antrag beschreibt die Kombination von gerichteter Evolution und rationalem Enzymdesign von C-MTasen mit dem Ziel einer verbesserten Übertragung von erweiterten Kohlenstoffketten von SAM-Analoga. Dabei ist es sehr schwierig geeignete Selektionsverfahren für MTasen zu entwickeln. Der erste Teil dieses Antrags beschreibt die gerichtete Evolution der DNA MTase M.SssI auf SAM-Analoga. Dafür soll die Methode der in vitro Kompartimentierung (IVC) verwendet werden, bei welcher eine Genbank in kleine Wasser in Öl Emulstionströpfchen verpackt wird in denen die in vitro Expression der Genvarianten abläuft. Zur Selektion positiver Klone macht man sich die Tatsache zu Nutze, dass DNA- Methylierung vor der Fragmentierung durch kognate Restriktionsenzyme schützt. Somit stellt diese Methodik eine Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp her und ermöglicht eine effektive Selektion von evolvierten Enzymvarianten. Die Ergebnisse der M.SssI Evolution sollen dann für ein rationales Enzymdesign von NovO (methyliert kleine Moleküle) verwendet werden. Aufgrund der großen strukturellen Ähnlichkeiten beider Enzyme in Bezug auf ihren Faltungstyp, welcher auch die Kofaktorbindestelle enthält, ist eine Kombination von Zufallsmutagenese mit anschließender gerichteter Evolution von M.SssI und rationalem Design von NovO, sinnvoll. Neben der Analyse von Enzymaktivitäten sollen auch biophysikalische Methoden zur Aufklärung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen angewendet werden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten von MTasen und Kofaktoren wird die Bedeutung einzelner Mutationen bezüglich der Kofaktor Spezifität hervorheben. Zusammenfassend sollen die Ergebnisse dieses Projektes zu einer weiteren Aufklärung und möglichen Anwendung von enzymatischen Alkylübertragungen führen.

Im Laufe des Projektes Änderung der Kofaktor Spezifität von Methyltransferasen wurde ein neuartiger experimenteller Ansatz zur Beschreibung der Selektion gefunden, die während einer im Labor durchgeführten gerichteten Evolution geschieht, gefunden. Im Unterschied zur natürlichen Evolution läuft die gerichtete Evolution, welche als Ziel die Isolierung von neuen Proteinvarianten definiert, sehr schnell ab. Dafür entscheidend ist wohl die Tatsache, dass bei der gerichteten Evolution nur ein einziges Protein unter bestimmten Bedingungen evolviert wird. Bis jetzt gab es keine Versuche den Selektionsprozess auf molekularer Ebene zu untersuchen, sondern der Fokus lag im Ergebnis der gerichteten Evolution. Wir machten uns die aufstrebende Technologie des Next Generation Sequencing zu Nutze, um einzelne DNA Moleküle in einer Ansammlung von DNA Molekülen zu untersuchen. Auf diese Weise konnte die Auswirkung des Selektionsdrucks, in unserem Fall die Konzentration des Interaktionspartners des Proteins, auf bestimmte DNA Spezies ganz klar verfolgt werden. Besonders interessant war die Entdeckung, dass es bei einer geringen Konzentrationen des Interaktionspartners zu einer deutlichen Selektion der Ausgangsspezies kommt. Anders ausgedrückt erlaubt eine ressourcenarme Umgebung nur der am besten angepassten Spezies das Überleben. Im Unterschied dazu führte eine hohe Konzentration des Interaktionspartners zu nahezu keiner Selektion beziehungsweise erlaubte einer Vielzahl an Spezies das Überleben in einer ressourcenreichen Umgebung. Andererseits zeigte sich, dass zur Isolierung von neuen Varianten mit neuen Aktivitäten ein Überschuss an nicht natürlichen Interaktionspartnern vorhanden sein muss. Möglicherweise muss eine neue Ressource im ausreichenden Maße zur Verfügung stehen um neuen Varianten das Überleben zu ermöglichen. Theoretisch könnte aber auch eine größere Population von Vorteil sein. Unser Ansatz erlaubte neue Einblicke in die Mechanismen der evolutionären Selektion auf Einzelmolekül Ebene, und stellt eine Erschließung wissenschaftlichen Neulandes dar. Neben den Evolutionsstudien wurden auch rationale Veränderung an Proteinen durchgeführt, um Bereiche des Proteins zu identifizieren, welche für die Bindung des Interaktionspartners wichtig sind. Die Untersuchung von mehreren Proteinvarianten und einer Reihe von Interaktionspartnern lieferte Informationen über die Bindungsstärken und wichtigen Bereichen von Protein und Interaktionspartner. Diese Informationen sind besonders interessant für die Weiterentwicklung von Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionspartner-Studien und zur Entwicklung von biologischen Werkzeugen welche in der chemischen und pharmazeutischen Industrie gefragt sind.