VirD4s Rolle in frühen Stadien der Protein und DNA Sekretion

"Coupling Proteine" sind wichtige, phylogenetisch konservierte Schlüsselproteine bakterieller Typ IV Sekretionssysteme (T4SS). Sie vermitteln als Rezeptoren die Substraterkennung, regulieren den Zugang des zu übertragenden Substrates zum T4-Sekretionskanal und versorgen den Sekretionsprozess mit Energie. Um besser zu verstehen, wie T4SS ihre Substrate (Gene und Virulenzfaktoren) in das Zytosol von anderen Bakterien bzw. eukaryontischen Zielzellen einschleusen, ist es daher von immenser Bedeutung das komplexe Regulations- und Interaktionsnetzwerk dieser "Coupling Proteine" zu erforschen. Ein ideales Modelsystem dafür stellt das VirB/D4 T4SS des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens dar. Über dieses System wird DNA in Pflanzenzellen eingeschleust, die mit Hilfe von ebenfalls übertragenen bzw. wirtseigenen Proteinen in das pflanzliche Genom integriert wird. Dieses System stellt somit eines der wichtigsten gentechnischen Werkzeuge dar um transgene Pflanzen herzustellen. Umfangreiches Wissen über den Aufbau des Sekretionskanals und dessen Interaktionsnetzwerke in diesem T4SS ist bekannt. In diesem Projekt ist es geplant wichtige Aminosäuren und funktionelle Domänen des "Coupling Proteins" VirD4 des A. tumefaciens VirB/D4 T4SS zu identifizieren und zu klären in welchen Schritten der Substraterkennung und -übertragung diese beteiligt sind. Dafür wird eine zufällige Mutagenese von VirD4 durchgeführt werden. Weitergehend wird der Einfluss der entstandenen Mutationen auf den Transferprozess im Allgemeinen bzw. den verschiedenen Interaktions- und Regulationsschritten im Speziellen getestet werden. Die Resultate dieser Studie werden nicht nur unser Wissen über den Agrobacterium vermittelten Makromolekültransfer verbessern, sondern können auch auf andere, medizinisch relevante T4SS angewendet werden. Des Weiteren bildet diese Studie eine hervorragende Grundlage für weiterführende Analysen, die es uns schlussendlich ermöglichen werden T4SS so zu modifizieren, dass fremde Substrate (z.B. antimikrobielle Substanzen) erkannt und übertragen werden können. Die Ausnutzung und Modifikation dieser in der Natur weitverbreiteten und hoch effizienten Sekretionssysteme könnte damit neuartigen Gen- bzw. antimikrobiellen Therapien die Türen öffnen.

Bakterien gebrauchen spezialisierte Sekretionsprozesse, vermittelt durch Typ IV Sekretionssysteme (T4SSs), um Protein- und DNA-Moleküle in andere Bakterien, Pflanzen- oder Tierzellen zu übertragen. Infolgedessen sind T4SSs wichtige Faktoren bei der Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und der Virulenz von vielen bedeutenden Pathogenen. Typ IV Coupling Proteine sind essentielle Bestandteile von T4SSs. Sie vermitteln als Rezeptoren die Substraterkennung, regulieren den Zugang des zu übertragenden Substrates zum Typ IV Sekretionskanal und versorgen den Sekretionsprozess mit Energie. Dieses Projekt hat sich auf das Coupling Protein VirD4Atu des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens, eines der am besten untersuchten T4SS Paradigmen, fokusiert. Um wichtige Aminosäuren und funktionelle Domänen von VirD4Atu zu identifizieren und um zu klären in welchen Schritten der Substraterkennung und übertragung diese beteiligt sind, wurden zufällige aber auch spezifische Mutationen in VirD4Atu eingeführt und hinsichtlich ihres Einflusses auf den Tranferprozess untersucht.Um die Wichtigkeit der identifizierten Domänen zu verifizieren, wurden Proteinregionen von TraGRP4, dem Coupling Protein des konjugativen Plasmids RP4, mit Schlüsseldomänen von VirD4Atu ausgetauscht und die Fähigkeit dieser Hybridproteine verschiedenartige Substrate zu übertragen untersucht. Die Tatsache, dass diese Hybridproteine weder homo- noch heterologe Substrate übertragen konnten, bestätigt die Bedeutung der identifizierten Domänen und unterstreicht die Komplexität der involvierten Proteininteraktions-Netzwerke. Zusammenfassend konnten die Resultate dieser Studie unser Wissen über den Agrobacterium vermittelten Makromolekültransfer im Speziellen und den Aufbau vonCoupling Proteinen im Allgemeinen verbessern. Des Weiteren bildet diese Studie eine hervorragende Grundlage für weiterführende Analysen, die es uns schlussendlich ermöglichen werden T4SS so zu modifizieren, dass fremde Substrate (z.B. antimikrobielle Substanzen) erkannt und übertragen werden können und somit neuartigen Gen- bzw. antimikrobiellen Therapien die Türen geöffnet werden.