Struktur-/Funktionsanalyse von Heptosyltransferase I (WaaC)

Heptosyltransferase I (WaaC) ist ein bakterielles Enzym welches Heptose, ein seltenes auf Bakterien beschränktes Kohlenhydrat, (Donor) auf die innerste Schicht der Bakterienzellwand (Akzeptor) überträgt. Da sowohl Funktion als auch Verbreitung von WaaC innerhalb der Enterobacteriaceae hoch konserviert sind stellt sie ein sehr breites und hoch interessantes Ziel für die Entwicklung neuer antibiotischer und antivirulenz basierter Therapien dar. Während die Spezifizität von WaaC donorseitig bereits detailliert untersucht wurde, ist über die akzeptorseitige Spezifizität von WaaC wenig bekannt. Dies ist vor allem der hochkomplexen amphiphilen Natur des natürlichen Akzeptors, Lipid A-Kdo2 , geschuldet. Lipid A-Kdo2 besteht aus einem Fettsäure und einem Kohlenhydratteil, wobei die Kohlenhydrat-Enzym Interaktion für die Bindung an Waac relevant ist. Aufgrund der beinhalteten Fettsäuren war Lipid A-Kdo2 bisher äußerst schwer für übliche analytische Methoden wie NMR Spektroskopie oder Röntgenstruktur zugänglich. Kürzlich wurde allerdings gezeigt, das WaaC sehr wohl auch fettsäurefreies Lipid A-Kdo2 akzeptiert, womit die Tür für detaillierte spektroskopische Untersuchungen der Enzym-Kohlenhydrat Interaktion aufgestoßen wurde. Da aus dem bakteriellen Zellwandmaterial meist nur heterogene Kohlenhydratfraktionen gewonnen werden können, ist ein Zugriff auf definierte Substrukturen nur über chemische Synthese möglich. Zur detaillierten atomaren spektroskopischen Untersuchung sind definierte Substrukturen des Kohlenhydratanteils notwendig welche zu einem erheblichen Teil bereits im Rahmen vorangegangener Projekte mittels chemischer Synthese dargestellt und in einer einzigartigen Substanzdatenbank gesammelt werden konnten. In diesem interdisziplinären Projekt sollen umfassende Untersuchungen der WaaC - Akzeptor Interaktion mittels Methodik aus drei Disziplinen durchgeführt werden. Die organischen Synthese zur Bereitstellung von vier Teilstrukturen des natürlichen Akzeptors, welche nicht durch die bereits vorhandenen Substanzdatenbank abgedeckt ist, der Molekularbiologie zur Bereitstellung des Zielenzymes mittels Expression und Reinigung, sowie der NMR Spektroskopie (STD), Röntgenstrukturanalyse und molekularer Modellierung zur Untersuchung der Interaktion der Teilstrukturen mit dem Zielenzym. Die molekularbiologischen, spektroskopischen und notwendigen chemisch synthetischen Arbeiten werden mit einer stark interdisziplinär arbeitenden, etablierten, international renommierten Gruppe aus Kanada durchgeführt und das erworbene Wissen dann an das Heiminstitut zurück transferiert werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen das grundlegende Verständnis der Interaktion von bakteriellen Heptosyltransferasen und Ihren Substraten zu vertiefen und somit bei der zukünftigen Entwicklung von antibiotischen Wirkstoffen behilflich zu sein.

Im Rahmen dieses Projektes, konnte die bisher unerforschte Interaktion von Heptosyltransferase I (WaaC), einer bakteriellen Glykosyltransferase, mit ihrem Hauptsubstrat vermessen und im Detail untersucht werden. Die Ergebnisse dieses Projekts können dazu beitragen, den Weg für neue antibiotischen Substanzen und Antivirulenz basierte Therapien zu ebnen. WaaC ist ein hochkonserviertes bakterielles Enzym, welches Heptose (Donor), ein einzigartiges Kohlenhydrat, auf die Kernregion (Akzeptor) der bakteriellen Zellwand von Gram negativen Bakterien überträgt. Da dieses Enzym unter den enterobaceriaceae im Hinblick auf Funktion und Verbreitung so hochkonserviert ist, stellt es ein verheißungsvolles Ziel für die Entwicklung von neuen antibakteriellen Substanzen und Antivirulenz basierten Therapien dar. Die Spezifizität von WaaC im Hinblick auf den Donor wurde schon bereits erforscht während wenig bis gar nichts über die Akzeptor Spezifität bekannt war. Dies war vor allem der Komplexität von Lipid A-Kdo2, dem natürlichen Akzeptor geschuldet, welcher fast unlöslich in den meisten gängigen Lösungsmitteln ist, die eine genaue spektroskopische Untersuchung erlauben würden. Isolierung aus Bakterien und anschließende chemische Modifikationen dieses Moleküls erlaubten es uns, dieses Problem zu umgehen wodurch die eingehende Untersuchung der Spezifität möglich wurde. Durch den Einsatz von Protein Kristallographie wurde deutlich, wie entscheidend der Einfluss der Phosphat- und Carboxylgruppen auf den Bindungsprozess ist, welcher auch eine Konformationsänderung des Proteins bewirkt. Die Ergebnisse dieses Projekts tragen zu einem vertieften Verständnis der Heptosyltransferase-Akzeptoren Interaktion bei und werden Einfluss auf die Entwicklung neuer antimikrobieller Substanzen für antibiotische Therapien nehmen.