Thioredoxin Reduktase in Giardia lamblia

Giardia lamblia ist ein mikroaerophiler, einzelliger Darmparasit des Menschen und jährlich für hunderte Millionen von Krankheitsfällen weltweit verantwortlich. Zwar ist das von G. lamblia hervorgerufene Krankheitsbild, die Giardiose, nicht lebensbedrohlich aber die schweren, lange anhaltenden Durchfälle können bei Kindern zu Wachstumsretardierung führen. Behandelt wird die Giardiose in den meisten Fällen mit Metronidazol, einem Nitroimidazoltherapeutikum, das seine Wirksamkeit ausschließlich in Organismen mit mikroaerophiler bzw. anaerober Lebensweise entfaltet. Dieser Umstand ist durch die Notwendigkeit der Reduzierung und somit Aktivierung der Nitrogruppe gegeben, welche nur in weitgehend sauerstofffreier Umgebung verläuft. Die Zielmoleküle aktivierten Metronidazols sind wahrscheinlich mannigfaltig, umfassen jedoch zumindest einige Enzyme, u.a. das Redoxenzym Thioredoxinreduktase (TrxR), welches einen zentralen Faktor in der Sauerstoffabwehr der meisten Organismen darstellt. Die TrxR ist in diesem Zusammenhang besonders interessant, da sie nicht nur Zielmolekül aktivierten Metronidazoles ist, sondern auch genug Reduktionskraft besitzt, um Metronidazol zu aktivieren zu können, wodurch sie für die Toxizität Metronidazols womöglich eine Schlüsselrolle innehat. Aus bisherigen Untersuchungen war zwar bekannt, dass TrxR durch aktiviertes Metronidazol gebunden wird, ein Vorgang, der wie wir in anderen Organismen nachgewiesen haben, zu einer deutlichen Verminderung der Aktivität führt, allerdings sind die weitergehenden Konsequenzen unbekannt. Dies ist u.a. darauf zurückzuführen, dass praktisch nichts über das TrxR-vermittelte Redoxsystem in G. lamblia bekannt ist und keine Interaktionspartner des Enzyms beschrieben wurden. Es ist daher Ziel dieses Projekts, die Interaktionspartner der TrxR in G. lamblia zu identifizieren und zu charakterisieren. Auch eine Lokalisierung des Enzyms und seiner Interaktionspartner mittels Immunofluoreszenzmikroskopie wird durchgeführt werden. Weiters wird es Ziel dieses Projekts sein, über transgene Expressionsexperimente zu ermitteln, welchen Einfluss die TrxR auf die Metronidazolempfindlichkeit G. lamblias hat. In diesem Zusammenhang wird auch im dritten Jahr des Projekts, der Rückkehrphase an das Heiminstitut, die Rolle der Flavinreduktase in der Metronidazolresistenz in G. lamblia unter Anwendung zuvor erlernter Methoden ermittelt werden. Diese Enzymaktivität erwies sich gemäß unseren Untersuchungen der Metronidazolresistenz in T. vaginalis als maßgeblich an der Entstehung derselbigen beteiligt. Da auch in G. lamblia Resistenzen gegen Metronidazol beobachtet wurden, ist die weitere Erforschung der Metronidazolresistenz in G. lamblia unerlässlich, um gegebenenfalls Gegenstrategien entwickeln zu können.

Das Ziel dieses Projekts war es, die Bedeutung des Enzyms Thioredoxinreduktase (TrxR) für die Physiologie des einzelligen Humanparasiten Giardia lamblia herauszuarbeiten und ihr Potential als Zielmolekül für eine eventuelle antiparasitische Chemotherapie abzuschätzen. Giardien besiedeln den Dünndarm des Menschen oder von Tieren und sind an relativ geringe Sauerstoffkonzentrationen in ihrer Umgebung angepasst, weisen also eine sogenannte mikroaerophile Physiologie auf. Da hohe Konzentrationen von Sauerstoff giftig auf mikroaerophile Organismen wirken, müssen sie über effiziente Mechanismen verfügen, um diesen aus ihrer Umgebung zu entfernen, bzw. um oxidative Schäden, welche direkt oder indirekt durch Sauerstoff verursacht wurden, möglichst rasch zu reparieren. Die TrxR ist in dieser Hinsicht häufig von großer Bedeutung, da sie durch die Reduktion von anderen Faktoren, u.a. Thioredoxin (Trx) und Peroxiredoxin (Prx), sowohl oxidative Schäden an Proteinen behebt, als auch Wasserstoffperoxid, welches durch Exposition mit Sauerstoff in der Zelle entsteht, entfernt. Es ist daher anzunehmen, dass die gezielte Hemmung der TrxR Aktivität für den Parasiten schädlich ist und sie folglich als Zielmolekül für Therapeutika dienen kann. Interessanterweise verfügt die TrxR auch noch über eine weitere Aktivität, welche für den Parasiten aber nachteilig wirkt: sie kann außer ihrem normalem Substrat, Thioredoxin, auch nitrogruppenhaltige Verbindungen reduzieren und somit in eine toxische Form überführen. Die bekannteste Verbindung aus dieser Substanzklasse ist das Metronidazol, welches weltweit standardmäßig in der Behandlung von G. lamblia und anderen mikroaerophilen bzw. anaeroben Erregern eingesetzt wird.In diesem Projekt wurde diese doppelte Rolle der TrxR in G. lamblia untersucht. Es wurde einerseits getestet, ob die TrxR für den Parasiten überlebensnotwendig ist und andererseits, ob sie bei der Reduktion von Metronidazol eine relevante Rolle spielt. Zu diesem Zweck wurde die Expression der TrxR in G. lamblia manipuliert, d.h. stark erhöht und die resultierende Mutante auf physiologische Auffälligkeiten und ihre Anfälligkeit gegenüber Metronidazol und anderen Therapeutika geprüft. Tatsächlich erwies sich die Mutante als anfälliger für Metronidazol und andere Nitroverbindungen, wies aber sonst nur wenige physiologische Besonderheiten auf. Ein weiteres Ziel dieses Projekts war es, Interaktionspartner der TrxR in G. lamblia zu identifizieren, um ihre Bedeutung für den Parasiten besser abschätzen zu können. Unsere Versuche ergaben, dass die TrxR mit einer großen Zahl an Proteinen interagiert, allerdings auf eine unspezifische Weise.Zusammengefasst bestätigte dieses Projekt zwar die Bedeutung der TrxR als Aktivierungsenzym für diverse Therapeutika, v.a. Metronidazol. Ihre physiologische Bedeutung scheint aber geringer zu sein als bisher angenommen. Ob sie daher als Zielmolekül für neue, alternative Therapeutika dienen kann, ist fraglich.