Ein hochstabiles Mini-Protein zur molekularen Erkennung

Antikörper repräsentieren die am schnellsten wachsende Klasse an therapeutischen Proteinen. Sie werden zur Behandlung von verschiedensten Krankheiten, wie z.B. Krebs und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Die wichtigste Eigenschaft von Antikörpern ist deren Fähigkeit mit hoher Affinität und Spezifität an jedes beliebige Antigen zu binden. Mit Hilfe von sogenannten "display-Technologien" können heutzutage alternative Proteingerüste zur Entwicklung von Bindern herangezogen werden. Solche Proteine, die dann ebenfalls mit hoher Affinität und Spezifität an Antigene binden, sind extrem vielseitig anwendbar. Als Anwendungsbeispiele können die Konstruktion von multispezifischen Antikörpern (durch Fusion dieser Proteine an Antikörper), intrazelluläres Blockieren bestimmter Zielmoleküle und Signalwege, sowie Affinitätschromatographie und Detektionstests angeführt werden. Solche Proteingerüste sollten idealerweise folgende Eigenschaften aufweisen: hohe Stabilität, hohe Expressionsrate, geringe Größe, hohe Löslichkeit, wenig Aggregation und keine unspezifischen Interaktionen mit anderen Biomolekülen. Deswegen hat die gegenwärtige Studie zum Ziel, ein neues Bindergerüst zu entwickeln, das auf einem hochstabilen Protein aus einem hyperthermophilen Organismus basiert. Dieses Protein ist nicht nur höchst stabil, pH-resistent und löslich, sondern beinhaltet auch keine Cysteine. Diese Eigenschaft ermöglicht die billigere Produktion in E. coli, sowie intrazelluläre Anwendungen. Zuerst werden wir die biophysikalischen Eigenschaften dieses Proteins durch computergesteuertes Design weiter verbessern. Dies wird in Kollaboration mit Bruce Tidor gemacht werden, dessen Arbeitsgruppe sich am MIT befindet und in vergangenen Studien bereits erfolgreich mit dem Wittrup-Labor (das Host-Labor für das gegenwärtige Projekt; ebenfalls am MIT) kooperiert hat. Das daraus resultierende optimierte Proteingerüst wird anschließend als Fusionsprotein mit humanem IgG exprimiert werden um zu zeigen, dass es sich zur Generierung von multispezifischen Antikörpern eignet. Auf dem optimierten Proteingerüst basierend wird danach eine Proteinbibliothek mit zufallsmutierten Oberflächenpositionen konstruiert und auf der Oberfläche von Hefe exprimiert werden. Mittels einer neuartigen Mutagenesestrategie wird es möglich sein, die gesamte Diversität in einer hefeoberflächenexprimierten Bibliothek abzudecken. Diese Bibliothek wird zur Selektion von Bindern gegen verschiedenste Modellantigene verwendet werden. Schlussendlich werden die selektierten Klone in der Affinitätschromatographie, sowie zur gezielten intrazellulären Degradierung eines Transkriptionsfaktors eingesetzt werden. Diese auf dem optimierten Proteingerüst basierende Bibliothek wird die rasche Entwicklung hochstabiler Binder ermöglichen. Diese Binder werden sich bei der Konstruktion von multispezifischen Antikörpern, sowie bei intrazellulären Anwendungen als extrem nützlich erweisen. Außerdem werden diese neu entwickelten Proteine auf Grund der billigeren Produktion in E. coli eine kostengünstigere Alternative zu Antikörpern in diversen biotechnologischen Anwendungen (z.B. ELISA oder Affinitätschromatographie) darstellen. Die Verwendung in der Affinitätschromatographie wird während der Rückkehrphase im Labor von Christian Obinger am VIBT in Wien getestet werden.

Antikörper sind Abwehrmoleküle unseres Immunsystems, die körperfremde Moleküle spezifisch erkennen und somit für das Immunsystem markieren können. Ihre Fähigkeit im Prinzip an jedes erdenkliche Molekül spezifisch und fest binden zu können, hat dazu geführt, dass Antikörper für verschiedenste biotechnologische Anwendungen genutzt werden. Diese Anwendungen umfassen unter anderem diagnostische Labortests, diverse molekularbiologische Methoden in der Forschung und auch therapeutische Anwendungen, z.B. zur Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankungen. Ein Nachteil von Antikörpern ist jedoch deren aufwändige und teure Herstellung in Säugetierzellen, die Tatsache dass sie aus vielen Untereinheiten zusammengebaut werden müssen und deren Tendenz zur Instabilität und Aggregation. Deswegen haben wir in diesem Projekt eine Alternative zu Antikörpern entwickelt. Wir haben ein kleines, hochstabiles Protein (hier Mini-Protein genannt) so umgebaut, dass es an jedes beliebige Zielmolekül (Antigen) binden kann, so wie ein Antikörper. Im Gegensatz zu Antikörpern ist dieses Mini-Protein aber sehr stabil, besteht nur aus einer einzigen Untereinheit und kann außerdem kostengünstig in Bakterien hergestellt werden. Zuerst haben wir dieses Mini-Protein so weiterentwickelt, dass es nicht mehr unspezifisch an menschlichen Zellen klebt. Das optimierte Protein wurde anschließend an einer Seite so verändert, dass es an die gegebenen Zielmoleküle binden kann. Die erzielten Bindungsstärken (Affinitäten) und Spezifitäten waren dabei mit denen von Antikörpern vergleichbar. Es wurden zum Beispiel Mini-Proteine entwickelt, die spezifisch an Moleküle binden, die auf der Oberfläche von Krebszellen zu finden sind. Außerdem wurde auch ein Mini- Protein gebaut, das an ein Protein bindet, das in Krebszellen oft mutiert (verändert) ist. Dieses Mini-Protein bindet stärker an das mutierte Protein das in Krebszellen vorkommt, als an nicht mutierte Proteine in gesunden Zellen. Zusammenfassend wurde in diesem Projekt ein System entwickelt, mit dem Mini- Proteine so umgebaut werden können dass sie jedes beliebige Zielprotein erkennen können. Während der Rückkehrphase wurde dieses System auch schon erfolgreich auf der Universität für Bodenkultur in Wien etabliert und unter anderem in einem Kooperationsprojekt mit der St. Anna Kinderkrebsforschung eingesetzt.