Neue Zellulasen aus hyperthermophilen Organismen

Die enzymatische Hydrolyse von (Ligno)Zellulose durch Zellulasen ist ein Schlüsselfaktor bei der Produktion von Biotreibstoffen der zweiten Generation, einem wichtigen Gebiet im Bereich der erneuerbaren Energien. Zellulasen, die unter Extrembedingungen arbeiten z.B. extreme pH Werte, hohe Temperaturen und Drücke, organische Lösungsmittel oder ionische Flüssigkeiten sind für verschiedene industrielle Prozesse sehr begehrenswert. Man könnte sie zum Beispiel unter Bedingungen einsetzen, wie sie auch für die Vorbehandlung von Lignozellulosebiomasse benötigt werden. Zur Zeit sind Enzyme mit hoher Thermostabilität und effizienter Aktivität auf Lignocellulose nicht verfügbar. Potentiell geeignete Enzyme wurden in Mikroorganismen entdeckt, die in extremen Umgebungen leben, wie z.B. in heißen Quellen. Die Schwierigkeit liegt zur Zeit in der Expression dieser vielversprechenden Enzyme, und auch genetische Werkzeuge für diese Systeme fehlen. Würde man die strukturelle Basis der (Hyper)Thermostabilität dieser Zellulasen verstehen, hätte man die Mittel in der Hand um vorhandene Enzyme rationell weiterzuentwickeln und ihnen die gewünschte Stabilität zu verleihen. In dem hier vorgeschlagenen Projekt wollen wir zwei Zellulasen (EBI-244 und EBI-108) aus einem hyperthermophilen Konsortium exprimieren und charakterisieren. EBI-244 wurde bereits in Escherichia coli und Tabakpflanzen exprimiert. Das Konsortium besteht aus drei hyperthermophilen Archaeen und kann auf kristalliner Zellulose bei 90C wachsen. Mittels Metagenomanalyse wurden mehrere Glykosylhydrolasen identifiziert, darunter auch die Mehrdomänenzellulase EBI-244, die gegenüber Extrembedingungen erstaunlich widerstandsfähig ist und ein Temperaturoptimum von 109C hat. Ein solches Temperaturoptimum könnte zwar zu hoch für einige Prozesse sein, aber man kann von diesen und ähnlichen Zellulasen lernen wie sie ihre Stabilität und Aktivität unter Extrembedingungen erhalten können. Die beiden Enzyme EBI-244 und EBI-108 wurden ausgewählt, weil EBI-244 ein Mitglied der Glykosylhydrolasefamilie 5 (GH5) die höchste Aktivität aufwies, und EBI-108 (GH12) hohe Homologie mit einer Zellulase hat, deren Kristallstruktur bekannt ist, was Rückschlüsse auf Struktur- Funktionsbeziehungen ermöglicht. Weiters ist geplant, systematisch mögliche Glykosylierungssequenzen in den Enzymen zu mutieren, um den Einfluss der Glykosilierung auf Aktivität und Stabilität zu untersuchen. Darüber ist generell wenig bekannt, vor allem in Archaeen. Es wurde aber mehrfach die Hypothese aufgestellt, dass Glykosilierung eine wichtige Rolle in Aktivität und Thermostabilität auch und besonders in Zellulasen hat. Wir erwarten uns von den Ergebnissen dieser Studie, dass durch das Verständnis der Faktoren, die für die (Hyper)thermostabilität verantwortlich sind, neue Zellulasen mit einzigartigen Eigenschaften verfügbar gemacht werden. Detaillierte Kenntnis von Mechanismus, Aufbau, Einfluss der Glykosylierung und Substratspezifität werden verfügbar sein. Dieses Projekt wird einen tiefen Einblick in Zellulasen mit neuartigen Eigenschaften ergeben und dadurch können neue Strategien, um die Biotreibstoffproduktion aus Lignozellulose wirtschaftlich zu machen, entwickelt werden.

Um pflanzliche Lignozellulose als Rohstoff für Biotreibstoffe der zweiten Generation effizient nutzen zu können, ist deren enzymatischer Abbau mit Hilfe von Biokatalysatoren wie zum Beispiel Zellulasen von zentraler Wichtigkeit. Da Lignozellulose äusserst widerstandsfähig und komplex ist, ist eine Vorbehandlung des Materials vonnöten. Die Bedingungen bei der Vorbehandlung sind sehr harsch: extreme pH-Werte, hohe Temperaturen und Drücke, organische Lösungsmittel oder ionische Flüssigkeiten. Dies kann die Enzyme inaktivieren und zerstören. Um Vorbehandlung und enzymatischen Abbau industriell in einem Vorgang vereinen zu können, braucht es daher Biokatalysatoren mit herausragender Stabilität unter diesen extremen Bedingungen. EBI-244 ist eine hyperthermostabile Zellulase, die in einem Archaebakterium, das in einer Thermalquelle in Nevada lebt, gefunden wurde. In diesem Projekt wurde EBI-244 erfolgreich in Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) produziert, da der Ursprungsorganismus wie viele andere Archaeen mit extremen Lebensbedingungen nicht im Labor wächst. Die hyperthermophile, archäische Zellulase EBI-244 hat ein Temperaturoptimum von 109C, einen Schmelzpunkt von 113C und ist widerstandsfähig gegenüber hohen Salzkonzentrationen, organischen Lösungsmitteln und ionischen Flüssigkeiten. Daher bietet es sich als Kandidat für eine industriell nutzbare Zellulase an. Zuvor ist EBI-244 im Modellbakterium Escherichia coli produziert worden, allerdings mit geringer Ausbeute. Das pflanzenproduzierte Protein hingegen wurde in guten Mengen (0.3 mg Protein pro g Blätter) hergestellt und hatte dieselbe Temperatur- und pH-Stabilität wie das bakterielle Enzym. Nach erfolgreicher Produktion einer großen Menge (2 g) EBI-244 in Pflanzen habe ich eine umfassende Charakterisierung der Zellulase begonnen hinsichtlich Temperatur- und pH-Stabilität, Aktivität auf löslichen und unlöslichen Substraten und posttranslationalen Modifikationen. Am höchsten war die Aktivität von EBI-244 auf Mannan und Lichenin; die Aktivität auf Carboxymethylzellulose und ß- Glukan aus Gerste war zwei- bis fünffach niedriger im Vergleich. Weiters wurde auch geringe Aktivität auf kristalliner Zellulose, Maisstroh und Miscanthus gemessen. Interessanterweise wurden neben einigen N-Glykosilierungstellen auch O-Glykosilierungsstellen gefunden und identifiziert. Das ist vor allem deshalb interessant, weil darüber in Pflanzen noch kaum berichtet wurde. Komplementär dazu habe ich auch untersucht ob EBI-244 als enzymatische Zugabe im Hochtemperaturvorbehandlungsprozess von Biomasse geeignet wäre. Das wäre aufgrund der hervorragenden Stabilität des Enzyms bei hohen Temperaturen und Salzkonzentrationen sowie gegenüber Lösungsmitteln von besonderem Interesse. Allerdings zeigte ein Vergleichstest von mit EBI-244 vorbehandelter und unbehandelter Biomasse beim anschließenden Verdau mit einem üblichen Zellulasesystem keine erhöhten Zuckerfreisetzung. Daher könnte die Verwendung von EBI- 244 als industrielles Enzym limitiert sein.