Methoden zur Untersuchung der Arginin-Phosphorylierung

Die Posttranslationale Modifikation von Proteinen durch die reversible Bindung von Phosphat- Molekuelen (Phosphorylierung) ist ein zentrales Merkmal aller Lebewesen. Diese Art der Modifikation unterliegt einer dynamischen Regulation durch Proteinkinasen, welche Phosphat- Gruppen anfuegen, und von Proteinphosphatasen, welche die Phosphat-Reste wieder entfernen. DieProtein-Phosphorylierung spielt eine wichtigeRolleinzahlreichen Signaluebertragungsprozessen und ist daher von grosser Bedeutung sowohl in der akademischen als auch in der biopharmazeutischenForschung. Proteinkinasen phosphorylieren ueblicherweise die Seitenketten von Serin, Threonin und Tyrosin Resten. Vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, dass Proteine auch an Arginin Resten phosphoryliert weden koennen. In Bakterien wird die reversible Arginin-Phosphorylierung durch die Argininkinase McsB unddie korrespondierendeArgininphosphataseYwlEvermittelt. Zusaetzlich wurde nachgewiesen dass die Phosphorylierung von Arginin-Resten zahlreiche zellulaere Signalwege, wie etwa die Stressantwort, den Protein-Abbau, die Zell-Beweglichkeit und die Kompetenz-Entwicklung in Bacillus subtilis, beeinflusst. Um die Erforschung dieses noch jungen Wissenschaftsgebietes weiter auszubauen werden neue chemische Methoden, die zur gezielten Isolierung und zur Markierung von Phosphoarginin modifizierenden Enzymen benutzt werden koennen, benoetigt. Das Ziel, des hier vorgestellten Forschungsprojektes, ist die Herstellung chemischer Sonden, welche selektiv Protein-Argininphosphatasen erkennen koennen. Die vorgeschlagenen Sonden bestehen aus einem Dreikomponentensystem, welches sich aus einem Phosphoarginin aehnelndemMolekuelteil, einemphotoreaktiven Anteil und einerReportergruppe zusammensetzt. Diese Sonden werden zur Visualisierung und zur Anreicherung von ArgininphosphatasenundPhosphoarginin-bindenden Proteinenin unterschiedlichen bakteriellen Organismen sowie in Saeugetier-Zellkulturen benutzt. Des weiteren planen wir die Synthese eines neuartigen Phosphoarginin-Substrats, welches zur raschen Ueberpruefung einer moeglichen Protein-Argininphosphatase Aktivitaet der identifizierten Proteine benutzt werden kann. Zusammenfassend dient das vorliegende Projekt zur Herstellung chemischer Werkzeuge, welche zu einem besseren Verstaendnis der zellulaeren Regulation und der Verbreitung der Protein-Argininphosphorylierung beitragen werden. In diesem Zusammenhang soll eine weiterfuehrende Erforschungder Protein-Argininphosphorylierungin unterschiedlichen Modellorganismen ermoeglicht werden.

Die Proteinphosphorylierung beeinflusst die Funktion zahlreicher Proteine und ist hauptverantwortlich für die Signalübertragung in Zellen. Neben der zentralen Stellung in der Regulation von Proteinen besitzt die Phosphorylierung von Proteinen auch eine entscheidende Rolle in unterschiedlichen Erkrankungen und ist daher von großem pharmazeutischem Interesse. Obwohl 20 verschiedene Aminosäuren in Proteinen vorkommen ist die Proteinphosphorylierung hauptsächlich auf den kovalenten Einbau von Phosphat Resten an die drei Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin beschränkt. Vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, dass auch die Aminosäure-Seitenkette von Arginin-Resten in Bakterien phosphoryliert werden kann. Ziel dieses vom FWF geförderten Projektes war die Herstellung von molekularen Werkzeugen zur besseren Charakterisierung dieser neuen Art der Proteinmodifikation hinsichtlich dessen Verbreitung und Regulation. Zu diesem Zweck wurden verschiedene niedermolekulare Phosphoarginin-Mimetika chemisch hergestellt. Diese Verbindungen besitzen ein hohe inhibitorische Wirksamkeit gegen die Protein-Arginin-Phosphatase YwlE, während Protein-Tyrosin-Phosphatasen nicht blockiert werden. In weiterer Folge wurden diese Inhibitoren als chemische Sonden adaptiert um die physiologische Regulation von YwlE zu untersuchen. Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass YwlE unter oxidativen Stressbedingungen inaktiv vorliegt und daher die Abspaltung von Phosphoarginin unterbunden wird, was in weiterer Folge zur Ansammlung von Arginin-phosphorylierten Proteinen führt. Aufgrund der bemerkenswerten chemischen Stabilität der synthetisierten Verbindungen wurden diese Moleküle als sogenannte Haptene zur Herstellung von Antikörpern gegen Phosphoarginin verwendet. Mittels dieser anti-Phosphoarginin-Antikörper konnte in einem ersten Schritt unser Modell bestätigt werden, dass die Argininphosphorylierung von Proteinen unter oxidativen Stress erhöht vorliegt. Basierend auf der erfolgreichen Verwendung der entwickelten Sonden wurde in einem weiteren Schritt versucht Protein-Arginin-Phosphatasen in unterschiedlichen Organismen nachzuweisen. Unter Verwendung der hergestellten Sonde konnte eine neue Protein-Arginin-Phosphatase in dem für Menschen gefährlichen Bakterium Staphylococcus aureus identifiziert werden.Zusammenfassend wurden im Verlauf dieses Projektes verschiedene molekulare Werkzeuge (Inhibitoren, Sonden und Antikörper) entwickelt, welche zu einer besseren Charakterisierung der biologischen Rolle und des pharmazeutischen Potentials der Protein Arginin Phosphorylierung beitragen werden.