Eine neue Screening-Methode für essentielle Kinasen in MPN

Kinasen gehören zu der Protein-Klasse, die am häufigsten mit Krebs assoziiert ist. Die Aufdeckung von Kinasen, welche an der Aufrechterhaltung von Krankheiten beteiligt sind verspricht die Entdeckung von potentiellen Medikamenten-Targets. Die Aktivität der meisten Kinase-Inhibitoren korreliert mit biochemischen Parametern, welche in vitro gemessen werden können. Mithilfe dieser Parameter ist es möglich die off-Target Effekte von Kinase-Inhibitoren auf jede der 518 Kinasen des humanen Kinoms aufzuklären. Bisher waren diese off-Targets (oft als Rauschen bezeichnet) ein großer Nachteil für jeden Medikamenten-Screen, der auf Kinase-Inhibitoren basierte. Ich beabsichtige eine neu, kostengünstige und zeitsparende Methode zu entwickeln welche nach essentiellen bzw. abhängigen Kinasen in Krebszelllinien sucht, indem sie das Rauschen zu ihrem Vorteil nutzt. Ich mache Gebrauch von einer detaillierten Darstellung der off-Target Effekte von 202 Kinase Inhibitoren auf 300 Kinasen, um einen Algorithmus zu entwickeln , welcher als Ergebnis eine Liste von diesen 300 Kinasen, gereiht nach ihrer Wichtigkeit für das Überleben/Proliferieren der Zelle, liefert. Getestet wird die Verlässlichkeit der Methode an mehreren humanen Zelllinien mit bekannter Kinase- Abhängigkeit, als auch an Ba/F3 Zellen, welche von der Aktivität von spezifischen humanen Kinasen abhängig sind. In einem preliminären Screen wurde die Methode und der Algorithmus bereits an 19 humanen Zelllinien getestet, welche eine publizierte Abhängigkeit von einer bestimmten Kinase (ABL1, JAK2, JAK3, FLT3, ALK, ErbB2 oder PDGFRa) vorweisen. Hierbei reihte der Algorithmus die korrekte essentielle Kinase im Durschnitt an Position 2,3 von insgesamt 300 Kinasen. Da die vorgestellte Methode nicht von spezifischen Inhibitoren abhängig ist und sie durch das Hinzufügen von weiteren Inhibitoren mit bekanntem off-Target Profil erweitert werden kann, stellt sie eine vielversprechende Alternative zu existierenden Screening-Methoden dar. Die Myeloproliferative Neoplasien (MPN) umfassen mehrere klonale hämatologische Erkrankungen welche aus seiner transformierten, hämatopoieischen Stammzelle hervorgehen. Die klinischen Hauptcharakteristiken sind eine Überproduktion von reifen, funktionellen Blutzellen und ein langer klinischer Verlauf. Obwohl JAK2 Inhibitoren die MPN-assoziierten Merkmale lindern und die Lebenserwartung leicht verlängern, haben klinische Studien nicht die hoch gesteckten Erwartungen erfüllen können. Ich werde meine Screening-Methode an JAK2V617F+ MPN Zelllinien anwenden, mit dem Ziel eine oder mehr Kinasen zu identifizieren, welche essentiell für JAK2V617F+ Zellen sind und somit zusätzliche Medikamenten-Targetsdarstellen. PreliminäreScreening-Datenvonfünf unterschiedlichen JAK2V617F-abhängigen Zelllinien weisen auf die Kinase p21-activated kinase 1 (PAK1) als essentielle Kinase in MPNs hin. Meine top-gereihten Kandidaten werde ich mittels pharmakologischer Inhibierung, shRNA vermittelten Knock-Down Experimenten und Studien an primären Patientenproben, als auch MPN Mausmodellen validieren. Für mein Rückholjahr am CeMM in Wien plane ich mein erworbenes Wissen und die neu etablierte Methode an BCR-ABL1+ CML Zellen anzuwenden, um nach potentiellen Mendikanten Targets abseits von BCR-ABL1 zu screenen.

Im Jahr 2005 wurde eine einzelne wiederkehrende aktivierende Mutation in der Tyrosinkinase JAK2 (JAK2V617F) in der Mehrheit an Patienten entdeckt, welche an der Blutkrankheit Myeloproliferative Neoplasie (MPN) erkrankt waren. Diese Entdeckung erlaubte präzisere Diagnosen and beschleunigte die Entwicklung von mehreren therapeutischen JAK2 Inhibitoren. Im Jahr 2013 wurden im Großteil an JAK2-unmutierten MPN Patienten somatische Mutationen im Gen CALR entdeckt. Um essentielle Kinasen zu entdecken, welche wichtig für das Überleben von CALR-mutierten Zellen sind, habe ich eine neue Methode entwickelt (KISMET), welche sich das komplette Ausmaß an Kinase Selektivitäten zu Nutze macht, welche für jeden verwendeten Inhibitor zu Verfügung steht. KISMET nutzt somit das so genannte off-target Rauschen, welches normalerweise gängige si-RNA oder Inhibitor-Screens limitiert. KISMET hat erfolgreich bekannte essentielle Kinasen in hämatopoetischen und nicht- hämatopoetischen Zelllinien identifiziert and hat weiters den Mitogen aktivierten Protein Kinase (MAPK) Signalweg als essentiell für das Wachstum der CALR-mutierten MARIMO Zelllinie aufgedeckt. Die Expression von mutiertem CALR in murinen oder humanen hämatopoetischen Zelllinien führte zu einer Aktivierung vom MAPK Signalweg, welche abhängig ist vom Protein MPL (Myeloproliferative Leukämie Protein). MPN Patienten mit mutiertem CALR zeigten weiters eine erhöhte MAPK Aktivität in CD34+ Zellen, Blutplättchen und Megakaryozyten. Obwohl mutiertes CALR eine erhöhte Proteininstabilität aufweist und von der proteosomalen Maschinerie abgebaut wird, konnte es die Megakaryopoese und Blutplättchenproduktion in humanen CD34+ Vorläuferzellen erhöhen. Diese Daten verbinden unnatürliche MAPK Aktivität mit dem MPN Phenotyp und identifizieren ihn als potentielles therapeutisches Ziel in MPN Patienten, welche positiv für mutiertes CALR sind. In Kollaboration mit der Gruppe von David Ron fanden wir heraus, dass mutiertes CALR sich im Kern anhäuft (im Gegensatz zu Wildtyp CALR, welches hauptsächlich in Cytoplasma vorgefunden wird). Das war eine sehr unerwartete und kontroverse Enddeckung und die Arbeit an diesem Projekt wird aktuell noch im Labor von Prof. Green fortgesetzt. Eine Deregulierung des JAK/STAT Signalweges wird häufig in verschiedenen Krebsarten gefunden, wobei der Transkriptionsfaktor STAT5AB das Überleben der Zelle, als auch den Fortschritt der Erkrankung kontrolliert. Da häufig Mutationen in STAT5B, aber nicht im verwandten Protein STAT5A in hämatopoetischen Tumoren entdeckt wurden, habe ich das BCR/ABL Modellsystem benutzt, um die Unterschiede zwischen STATA und STAT5B in der Leukämieentstehung zu beschreiben. Mein Ziel war es essentielle Signalwege zu identifizieren, die entweder durch STAT5A oder STAT5B aktiviert wurden und dadurch neue potentielle therapeutische Ansätze in der chronischen myeloiden Leukämie (CML) aufzeigten. Analysen via RNASeq zeigten eine verstärkte IFN-alpha und IFN-gamma Signatur in Zellen ohne STAT5B. Eine Inhibierung der Interferon-Antwort stellte in BCR/ABL+ Zellen die Formation von Kolonien in STAT5B-defizienten Zellen wieder her.