Bioorthogonale Bildgebung therapeutischer B-Raf-Inhibition

DieProteinkinaseB-Raf ist einwichtigerBestandteildesMAP-Kinase Signaltransduktionsweges, der unter anderem an der Regulation des Zellwachstums und des programmierten Zelltods beteiligt ist. Aufgrund des häufigen Auftretens einer definierten Mutation des entsprechenden Onkogens kommt es zur Bildung einer mutierten Form von B-Raf mit etwa 800-fach vergrößerter Aktivität, welche zu unkontrollierter Zellproliferation und erhöhtem Zellwachstum führt. Dies betrifft etwa 50% aller bösartigen Melanomerkrankungen, einer besonders aggressiven Form von Hautkrebs, und führt zu einer unverhältnismäßigen Anzahl an Todesfällen weltweit. Durch präklinische Studien wurde die besondere Bedeutung von B-Raf entdeckt und im Zuge von Wirkstoffentwicklungsprogrammen wurden mehrere Verbindungen als selektive Inhibitoren der mutierten B-Raf-Form identifiziert, welche teilweise bereits als Chemotherapeutika eingesetzt werden. Ziel des Projektes ist die Entwicklung einer Methode zur bioorthogonalen Bildgebung der Proteinkinase-Inhibition durch die vielversprechenden Wirkstoffe Vemurafenib und Dabrafenib. Basierend auf den chemischen Strukturen dieser neuartigen B-Raf-Inhibitoren sollen entsprechende Derivate durch Totalsynthese hergestellt und an einer geeigneten Stelle mit einem gespannten Cycloalken modifiziert werden. Diese bioorthogonale Gruppe ermöglicht eine äußerst selektive Reaktion mit substituierten Tetrazinen sowohl bei in vitro als auch in vivo Experimenten. Die Entwicklung von entsprechenden Substanzen mit äußerst wirkstoffähnlichen Eigenschaften sowie deren bildgebende Lokalisation durch bioorthogonale Reaktion mit fluorogenen Tetrazinen wird dadurch ermöglicht. Im Zuge dieses Vorhabens sollen verschieden modifizierte Verbindungen hergestellt und unter Anwendung von in vitro Methoden (inklusive Fluoreszenzmikroskopie von fixierten und lebenden Zellen) auf ihre inhibierende Wirkung untersucht werden. Die Spezifität dieser Verbindungen für die mutierte B-Raf-Form (u.a. durch Anwendung spezifischer Antikörper) wird ermittelt und bioorthogonale Proteomik-Methoden werden angewandt, um die polypharmakologischen Eigenschaften dieser Substanzen genauer untersuchen zu können, auch um Rückschlüsse auf die grundlegenden Wirkstoffe zu erhalten. Ausgewählte Leitstrukturen werden in weiterer Folge für die in vivo Visualisierung auf zellulärer Ebene verwendet. Dies soll abschließend zu einer optimierten Methode für die in vivo Bildgebung therapeutischer B-Raf-Inhibition und einem besseren Verständnis von pharmakokinetischen Aspekten sowie den zugrundeliegenden Mechanismen dieser für die Krebsforschung bedeutenden Thematik führen.

B-Raf ist ein Enzym und wichtiger Bestandteil der zellulären Signalweiterleitung, die an der Regulation des Zellwachstums und des programmierten Zelltods beteiligt ist. Aufgrund des häufigen Auftretens einer definierten B-Raf-Mutation kommt es zur Bildung einer mutierten Form mit etwa 800-fach vergrößerter Aktivität, welche zu unkontrolliertem und erhöhtem Zellwachstum führt. Dies betrifft etwa 50% aller bösartigen Melanomerkrankungen, einer besonders aggressiven Form von Hautkrebs, und führt zu einer unverhältnismäßigen Anzahl an Todesfällen weltweit. Ziel dieses Projektes war die Entwicklung von (bioorthogonalen) bildgebenden Substanzen für die Visualisierung therapeutischer B-Raf-Inhibition auf Basis der zugelassenen chemotherapeutischen Wirkstoffe Vemurafenib und Dabrafenib. Modifizierbare Analoga dieser Verbindungen wurden hergestellt, welche in weiterer Folge mit unterschiedlichen Fluorophoren konjugiert wurden, mit dem Ziel die Bindung zu B-Raf möglichst wenig zu beeinflussen. Ein grün-fluoreszierendes Derivat von Vemurafenib wurde hergestellt, welches erfolgreich zur Bildgebung in Zellen sowie in vivo verwendet wurde. Zudem konnte ein bioorthogonales Derivat von Dabrafenib entwickelt werden, welches die Identifikation von Bindungspartnern und zellulären Targets ermöglicht. Eine solche bioorthogonale Verbindung beinhaltet eine bioinerte, stabile funktionelle Gruppe, die die Bindung an B-Raf in Zellen nicht maßgeblich beeinflusst. In weiterer Folge kann diese bioorthogonale Gruppe allerdings mit dem bioorthogonalen Gegenstück in der lebenden Zelle reagieren. Auf diese Weise konnten so genannte Smart Probes eingesetzt werden, die eine Bildgebung ohne zusätzliche Waschschritte ermöglichen, da diese erst nach erfolgter bioorthogonaler Reaktion fluoreszieren. Dies ist von großer Wichtigkeit, wenn Verbindungen visualisiert werden sollen, die aufgrund von nicht-permanenter Bindung an das Target bei üblicherweise notwendigen Waschschritten wieder abgespalten werden. Die Verfügbarkeit eines solchen bioorthogonalen Systems in Kombination mit direkt markierten fluoreszierenden Verbindungen hat es ermöglicht, erste Studien zur Wirkstoffaufnahme in resistenten Zellen durchzuführen. Des Weiteren konnte die bioorthogonale Strategie angewendet werden, um Wirkstoffvorstufen durch bioorthogonale Reaktion in der Tumorzelle zu aktivieren. Zusammengefasst, konnten direkt bildgebende sowie bioorthogonale Analoga der Wirkstoffe Vemurafenib und Dabrafenib entwickelt werden, welche eine bessere Untersuchung (Diagnostik) sowie neue Methoden in der therapeutischen B-Raf Inhibition ermöglichen.