Identifikation von APC/C-Substraten in der Cytokinese

Die Teilung des Cytoplasmas, kurz Cytokinese, erfolgt im Anschluss an die Mitose (Zellkernteilung) und ist essentiell für eine korrekt ablaufende Zellteilung. Störungen der in der Cytokinese ablaufenden Prozesse führen zu Aneuploidie, die in weiterer Folge Entwicklungsstörungen oder Krebs verursachen kann. Obwohl die Cytokinese einen wichtigen Abschnitt des Zellzyklus darstellt, konnten regulatorische Mechanismen bislang kaum erforscht werden, da entsprechende biochemische Verfahren erst in den letzten Jahren entwickelt wurden. Relevante Vorgänge dieser Phase werden durch Ubiquitin-gesteuerte Proteolyse reguliert, wobei der Proteinkomplex APC/C eine zentrale Rolle einnimmt. Dieser ist daher von entscheidender Bedeutung für die Zellteilung und somit Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen, die zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen führen sollen. Im Zuge des geplanten Projektes werden neue Methoden zur Identifizierung von APC/C-Substraten der Cytokinese mit Hilfe von quantitativer und dynamischer Proteinanalytik entwickelt und umgesetzt. Durch pharmakologische Synchronisation von HeLa S3 Zellen werden Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus (mit dem Schwerpunkt auf Cytokinese) erhalten. Isobarenmarkierung(iTRAQ) und anschließendeLC-MS-Analytikwerdenkombiniert zur quantitativen Proteomanalyse eingesetzt. Die erhaltenen Daten werden unter Anwendung neuartiger bioinformatischer Methoden (Protein Profile Similarity Screening, PPSS) analysiert. Dabei werden zunächst Modellprofile basierend auf bereits identifizierten, für die Cytokinese relevanten, APC/C-Substraten erstellt. Durch einen Vergleich mit den ermittelten Profilen aller untersuchter Proteine soll in weiterer Folge eine hochqualitative Auswahl an möglichen und bislang unbekannten Substraten erhalten werden. Diese sollen abschließend durch Anwendung biochemischer Methoden als APC/C-Substrate bestätigt oder ausgeschlossen werden. Die Identifikation neuer APC/C-Substrate und deren Verlauf im Zuge der Zellteilung sollen dazu beitragen, Fehlregulierungen in der Cytokinese besser untersuchen zu können. Dies soll in weiterer Folge die Identifikation von möglichen Targets für die Entwicklung therapeutischer Ansätze ermöglichen.

Die Teilung des Cytoplasmas, kurz Cytokinese, erfolgt im Anschluss an die Mitose (Zellkernteilung) und ist essentiell für eine korrekt ablaufende Zellteilung. Störungen der in der Cytokinese ablaufenden Prozesse führen zu Aneuploidie, die in weiterer Folge Entwicklungsstörungen oder Krebs verursachen kann. Obwohl die Cytokinese einen wichtigen Abschnitt des Zellzyklus darstellt, konnten regulatorische Mechanismen bislang kaum erforscht werden, da entsprechende biochemische Verfahren erst in den letzten Jahren entwickelt wurden. Relevante Vorgänge dieser Phase werden durch Ubiquitin-gesteuerte Proteolyse reguliert, wobei der Proteinkomplex APC/C eine zentrale Rolle einnimmt. Dieser ist daher von entscheidender Bedeutung für die Zellteilung und somit Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen, die zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen führen sollen. Im Zuge dieses Projektes wurden neue Methoden zur Identifizierung von APC/C-Substraten der Cytokinese mit Hilfe von quantitativer und dynamischer Proteinanalytik entwickelt und umgesetzt. Durch pharmakologische Synchronisation von HeLa S3 Zellen wurden Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus (mit dem Schwerpunkt auf Cytokinese) erhalten. Isobarenmarkierung und anschließende LC-MS-Analytik wurden kombiniert zur quantitativen Proteomanalyse eingesetzt. Die erhaltenen Daten wurden unter Anwendung neuartiger bioinformatischer Methoden (Protein Profile Similarity Screening, PPSS) analysiert. Dabei wurden zunächst Modellprofile basierend auf bereits identifizierten, für die Cytokinese relevanten, APC/C-Substraten erstellt. Durch einen Vergleich mit den ermittelten Profilen aller untersuchten Proteine wurde in weiterer Folge eine hochqualitative Auswahl an möglichen und bislang unbekannten Substraten erhalten. Diese sollten durch Anwendung biochemischer Methoden als APC/C-Substrate bestätigt oder ausgeschlossen werden. Abschließend, sollten posttranslationale Modifikationen dieser Substrate untersucht werden. Die Identifikation neuer APC/C-Substrate und deren Verlauf im Zuge der Zellteilung sollen dazu beitragen, Fehlregulierungen in der Cytokinese besser untersuchen zu können. Dies soll in weiterer Folge die Entwicklung therapeutischer Ansätze ermöglichen.