Genetische Verfolgung antifungaler Wirkungsmechanismen

Etwa 1,5 Millionen Menschen sterben jährlich an Infektionen mit pathogenen Pilzen. Diese Zahl übersteigt die geschätzte Todesrate von Tuberkulose und Malaria. Trotz der Verfügbarkeit diverser antifungaler Medikamente, liegt die Sterblichkeitsrate invasiver Pilzinfektionen häufig bei über 50% (Brown et al, 2012). Zudem sind diese Medikamente zum Teil hoch toxisch, limitiert bioverfügbar und weisen eine nur geringe Wirksamkeit gegen bestimmte Krankheitstypen auf. Aufgrund verlängerter Exposition von Patienten mit diesen Medikamenten kommt es auch immer häufiger zur Bildung von Resistenzen, was besonders für immunsupprimierte Patienten ein immenses Gesundheitsrisiko darstellt (Snelders et al, 2012). Die Industrie hat sich größtenteils aus der Erforschung antifungaler Arzneimittel, Entdeckung von Zielproteinen (Proteine, die durch die Verabreichung antifungaler Medikamente inhibiert werden) und deren Validierung, zurückgezogen. Dadurch ist ein Mangel an antifungalen Agenzien in kommerziellen Entwicklungspipelines entstanden, der den Einstieg der universitären Wissenschaft in die Erforschung von neuen Therapeutika unbedingt erforderlich macht. Antifungale Therapeutika mit neuem Wirkungsmechanismus werden dringend benötigt, um dem Problem der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Ein erster Schritt zur Lösung des Problems stellt die Identifizierung von essenziellen zellulären Prozessen oder Zielproteinen dar, die effektiv inhibiert werden können. Das primäre Ziel dieses Projekts ist die Identifizierung neuartiger Zielproteine in filamentösen Pilzen durch Entschlüsselung von bisher unbekannten Wirkungsmechanismen potenter, antifungaler Medikamente und gleichzeitiger Untersuchung des Resistenzbildungsspotenzials. Im Rahmen dieses Projekts werde ich transkriptionelle Reaktionen von A. fumigatus auf die Behandlung mit Arzneistoffen untersuchen, deren Wirkungsmechanismus sowohl bekannt als auch bislang unbekannt ist. Die Transkriptionsprofile werden herangezogen, um spezifische, durch diese Therapeutika induzierte, von generellen Stress-induzierten Reaktionen zu unterscheiden. Des Weiteren soll durch die Behandlung einer genomweiten A. fumigatus Transkriptionsfaktor (TF) Deletions-Stammkollektion (350 Deletionsmutanten) mit diesen Agenzien und anschließende Fitnessanalysen transkriptionelle Netzwerke entschlüsselt werden, die Resistenz vermitteln. Dieser Aspekt des Projekts dient der Identifizierung von TFs, deren Mutation zu veränderter Sensitivität gegenüber bestimmter Medikamente führt und deshalb ein hohes Risiko zur Resistenzbildung birgt. Durch den Vergleich der Transkriptionsprofile von A. fumigatus Wildtyp und TF Mutanten sollen Stoffwechselwege identifiziert werden, die von diesen TFs reguliert werden. Ein weiteres Ziel stellt die Enthüllung neuer, Arzneistoff-spezifischer Zielproteine durch Erhöhung der individuellen Gendosis mit genom-weiter Abdeckung dar. Hierfür wird das autonom-replizierende Plasmid pAMA1 verwendet. pAMA1 wurde erfolgreich in Screenings eingesetzt, in denen sowohl individuelle Gene als auch gesamte Genome überexprimiert wurden. Dies ermöglichte die Identifizierung von Genen, die die Resistenz gegenüber bestimmter Therapeutika erhöhen (Liu et al, 2004; Osherov et al, 2001). Darüber hinaus soll die Funktionalität, der im Zuge dieses Projekts identifizierten Zielgene, charakterisiert, sowie deren Rolle in Virulenz und Physiologie untersucht werden. Die gewonnenen Erkenntnisse dieser Experimente sollen kombiniert werden um unser Wissen über Wirkungsmechanismen antifungaler Agenzien zu erweitern, was die Identifizierung und Validierung neuer Zielproteine ermöglicht.

Ziel dieses Projekts war die Identifikation von neuartigen antifungalen Zielmolekülen sowie die Charakterisierung von Resistenzmechanismen gegen antifungale Medikamente, die zur klinischen Behandlung von Pilzinfektionen eingesetzt werden. Ein Teil meiner Arbeit beinhaltete die molekulare Analyse eines der am häufigsten auftretenden Resistenzmechanismen gegen die Medikamentklasse Azole. Azole sind die Haupt-Medikamentklasse, die zur Behandlung von Pilzinfektionen eingesetzt werden, weshalb die Resistenzentwicklung gegen diese Klasse ein besorgniserregendes Problem darstellt. Die antifungale Wirkung von Azolen wird durch Inhibition der Ergosterolbiosynthese (Ergosterol entspricht Cholesterin in humanen Zellen) im Pilzpathogen entfaltet, genauer durch die Blockierung des Enzyms Cyp51, der Sterol 14a-demethylase. Der untersuchte Resistenzmechanismus ist unter anderem gekennzeichnet durch eine DNA Duplikation im cyp51A Promotor und eine daraus resultierende, erhöhte Expression des Gens. Frühere Studien haben das Regulatorprotein SrbA als Aktivator von cyp51A entschlüsselt. Forschungsergebnisse aus diesem Projekt haben nun gezeigt, dass die genannte Duplikation von DNA im Promotor des Gens zur erhöhten Bindung von SrbA und folglich zur gesteigerten Expression von cyp51A führt, was unter anderem zur Azolresistenz beiträgt. Ein zweiter Azol-Resistenzmechanismus, der in diesem Projekt entschlüsselt wurde, ist zurückzuführen auf eine Mutation des CCAAT Bindungskomplexes CBC, einem Transkriptionsfaktor bestehend aus den drei Untereinheiten HapB/C/E. Eine Genmutation, die einen Prolin zu Leucin Aminosäureaustausch in Position 88 in der Untereinheit HapE (HapEP88L) zur Folge hat, führte zur Resistenz in einem klinischen Isolat. Wir konnten zeigen, dass die Mutation des CBC zu erhöhter Expression einer Vielzahl von Genen des Ergosterol- Biosyntheseweges führt. Dies führt zur erhöhten Produktion von Sterolen in der Pilzzelle und schlussendlich zur Resistenz gegen Azole. Im einem weiteren Teil des Projekts wurde die intrinsische 5-Flucytosin (5FC) Toleranz in A. fumigatus untersucht. 5FC wird kaum für die Behandlung von Aspergillose eingesetzt. Dieses Medikament ist bei neutralem pH, was den pH in den meisten Flüssigkeiten unseres Körpers widerspiegelt, kaum aktiv. Wir konnten das Protein (FcyB), welches hauptsächlich für den Transport von 5FC in die Pilzzelle verantwortlich ist, charakterisieren. Expressionsanalysen haben gezeigt, dass die Genexpression von fcyB bei neutralem pH reprimiert wird. Im Gegensatz dazu, wird die Expression des Gens bei saurem pH aktiviert, was zu erhöhter Aufnahme und dadurch gesteigerter Aktivität von 5FC führt. Wir konnten außerdem zeigen, dass die Repression von fcyB bei neutralem pH durch zwei regulatorische Proteine - den CBC und PacC vermittelt wird.