Erforschung der Reovirus Infektion

Der Titel des eingereichten Projekts lautet Erforschung der Reovirus Infektion Vom Aufsetzen zum Zelleintritt. Viren sind kleine Partikel, welche sich exklusiv reproduzieren, indem sie die Zellmaschinerie lebender Zellen benutzen. Auf Grund ihrer Einfachheit hängen Viren in annähernd allen Stadien des Infektionszyklus von Wirtsorganismen ab. Während Millionen von Jahren anhaltender Evolution und Anpassung an zelluläre Wirtsorganismen haben Viren die relevanten Passwörter oder Eintrittskarten erworben und sind somit in der Lage, zelluläre Funktionen zu kontrollieren und für sich zu benutzen. Der Infektionszyklus eines Viruspartikels besteht aus einer Serie von aufeinanderfolgenden Schritten, beginnend mit der Landung oder dem Aufsetzen des Virus auf der Zelloberfläche durch vorausgehende Interaktionen zwischen dem Virion und den freiliegenden Zelloberflächen-Molekülen (Zelloberflächenrezeptoren). Wirtszell-Penetration (viraler Eintritt) folgt der Anhaftung und in weiterer Folge von Freilegung, Virusreplikation, Zusammenschluss und schlussendlich der Virusentlassung von der Wirtszelle. Wir werden den ersten Schritt des Aufsetzens eines Virus auf einer lebenden Zelle untersuchen und sehen, wie der Virus sich an Zelloberflächen-Rezeptoren bindet, da diese Prozesse bis heute kaum verstanden sind, aber neues Potential für therapeutische Strategien liefern. In dem eingereichten Projekt liegt der Fokus auf Reoviren, welche in tödliche Hirnentzündungen involviert sind, aber auch onkolytische Eigenschaften besitzen. Letzteres begünstigt die Entwicklung von Reovirus-basierenden Therapien für Krebserkrankungen. Wir werden untersuchen, wie sich ein einzelner Virus an die Zelloberfläche bindet, wie die Zelloberflächenrezeptoren jeweils zur Bindung beitragen und somit die Dynamiken des ersten Viruseintritt-Schritts enträtseln. Weiterhin, planen wir, einen einzelnen Virus spezifisch zu einer vorher ausgewählten Zelle abzuliefern. Dies ist wichtig für bestimme Anwendungen ist, z.B.: genetisches Material für den Kampf gegen einen Tumor zu übermitteln. Zu diesem Zweck werden wir das Rasterkraftmikroskop (engl. atomic force microscope AFM) benutzen. Dieses Mikroskop wird wie ein nanoskopischer Sensor verwendet, welcher in der Lage ist, Interaktionen auf Einzelmolekülebene zu messen, z.B. unvorstellbar niedrige Kräfte (trillionstel Newton) zwischen Zelloberflächenrezeptoren und Viren. Hierzu können wir einen Virus an eine Art Angel (sog. Cantilever ausgestattet mit einer Verbindungsschnur) anhängen. Weiterhin können wir mit dem AFM auch biologische Strukturen in der Größenordnung von nur ein paar millionstel Millimeter visualisieren, was es möglich macht, einzelne Viren auf einer Zelle zu lokalisieren. Durch das Anhängen eines Virus an die Messnadel (Cantilever) können wir wiederum spezifisch diesen einzelnen Virus bei einer Zelle abliefern, indem wir die Verbindungsschnur zur richtigen Zeit und am richtigen Ort zerschneiden. Dieses interdisziplinäre Projekt kombiniert Aspekte der Bio- Nanotechnologie, Virologie, Chemie, Medizin und Biophysik und wird unser Wissen in der quantitativen Beschreibung der Virusinfektion weiterführen. Weiterhin wird es Licht auf das komplexe Thema der Reovirus Rolle in seiner Eignung als krebsvernichtendes Reagens werfen.

Glykane drücken den Abzug, aber JAM-A initiiert den Eintritt von Reoviren in lebende Zellen: Aufklärung des Rätsels hinter den molekularen und mechanistischen Grundlagen der Bindung von Reoviren an die Zelloberfläche mithilfe von hochentwickelten Nanoskopiemethoden Obwohl nicht als häufiger Erreger bekannt, wurde gezeigt, dass eine Reovirus-Infektion durch Brechen der immunologischen Toleranz gegenüber oral aufgenommenem Gluten zur Entwicklung einer Zöliakie beiträgt. Darüber hinaus lysiert das Reovirus Tumorzellen effizient und hat in klinischen Studien Wirksamkeit bei widerstandsfähigen Krebserkrankungen gezeigt. Die molekulare und mechanistische Grundlage der Bindung von Reoviren an die Zelloberfläche ist jedoch immer noch rätselhaft. Das derzeitige Wissen über den Viruseintritt beruht hauptsächlich auf Ensemble-Studien, die nur den Durchschnitt einer Population liefern. Die Virusinfektion ist jedoch ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Dynamik jedes einzelnen Schritts von entscheidender Bedeutung ist und die Tendenz von Virionen, polyvalente Wechselwirkungen herzustellen, das Gesamtbild erschwert. Ein bisschen wie die FBI-Spezialagenten Mulder und Scully wollten wir dieses Rätsel lösen, indem wir alle an diesem komplexen Mechanismus beteiligten Täter identifizierten und versuchten, eine mögliche obskurer Verschwörung aufzudecken. Mit Hilfe einer fortschrittlichen Waffe, bestehend aus einem Rasterkraftmikroskop in Kombination mit einem konfokalen Mikroskop, bewachten wir lebende Säugetierzellen, und beobachten den versuchten Eintritt einzelner Viren. Mit einer nanoskopischen Angelrute (Cantilever) dekoriert mit einzelnen Virionen als Köder, haben wir die Wechselwirkung der Virionen mit der Zelloberfläche aufgezeichnet und so einen wichtigen Durchbruch im Bindungsmechanismus des Reovirus entdeckt. Wir haben gezeigt, dass die frühe Bindung des Reovirus an die Zelloberfläche durch Glykane reguliert wird und dass die Bindungsfaktoren (Sialinsäure für Reoviren) mehr als "einfache Bindungen oder unspezifische Schritte" sind, wie zuvor angenommen. Unsere Studie zeigt ein physiologisch relevantes Zusammenspiel zwischen Bindungsfaktoren (-verknüpfte Sialinsäureglykane [-SA]) und einem spezifischen Eintrittsrezeptor (Junctional adhesion molecule A [JAM-A]). Es ist das erste Mal, dass eine solche direkte Koalition zwischen Virus, Bindungsfaktoren und spezifischen Eintrittsrezeptoren während einer Virusinfektion beobachtet wird. Unsere in-vitro- und Zellexperimente zeigen tatsächlich eine bislang unbekannte Konsolidierung: Die Bindung an -SA, die mit geringer Affinität verbunden ist, dient als anfängliches Bindungsereignis und löst eine Konformationsänderung im viralen 1-Bindungsprotein aus, die die Wechselwirkung mit dem hochaffinen JAM-A-Rezeptor weiter verstärkt. Dieser zweistufige Mechanismus zur Stärkung der Adhäsion wurde bisher nur angedeutet und nicht direkt für Viren gezeigt und liefert Hinweise auf ein Glykan-vermitteltes Zell-Targeting, dass den viralen Tropismus beeinflusst. Mit diesem Ansatz konnten wir der Allgemeinheit einzigartige Möglichkeiten bieten, die Effizienz und Infektiosität der Reovirusbindung zu manipulieren, wichtig für die Impfstoffentwicklung und andere onkolytische Anwendungen. In diesem Zusammenhang haben wir herausgefunden, dass kurze spezifische Glykane verwendet werden können, um das Virionbindungspotential zu verbessern, was eine aufregende Anwendung für beide Anwendungen bietet.