CBH I von Trichoderma hydrolysiert Chitosan

Das Projekt CBH-ChitoMech untersucht die Mechanismen der Hydrolyse von Chitosan durch eine Cellobiohydrolase I von Hypocrea jecorina (HjCBH). Chitosan ist ein Polysaccharid das vor allem aus Krustentierschalen, aber auch aus Pilzen gewonnen wird. Dieses Naturprodukt erfreut sich vermehrt Beliebtheit in medizinischen Anwendungen durch dessen antimikrobielle Aktivität und Biokompatibilität. Vor allem die Hydrolyse Produkte von Chitosan, Chitooligosaccharide (COSs), sind von großen Interesse, da neueste Forschungsergebnisse eine Vielzahl gesundheitsfördernder Wirkungen beschreiben. Die Produktion von COSs stellt im Moment noch ein Hinderniss dar, da herkömmliche chemische Methoden zu heterogenen Produktgemischen führen, die schwer charkterisiert werden können. Die enzymatische Hydrolyse von Chitosan ist daher die bevorzugte Methode um homogene COSs herzustellen, jedoch sind Chitosan abbauende Enzyme (Chitosanasen) noch sehr teuer, wodurch eine wirtschaftliche Produktion nicht möglich ist. Vorangegangene Studien zeigen das Potential von kommerziellen Cellobiohydrolasen der Pilzgattung Trichoderma zur Produktion von COSs, wie zum Beispiel HjCBH. Ergänzend zu den bekannten Studien sind weitere mechanistische Untersuchungen nötig, um das volle Potential dieser Enzyme ausschöpfen zu können. Mechanistische Studien benötigengut charakterisierte Modellsubstanzen umdetaillierte kinetische Studien durchzuführen. Im Rahmen des Projekts werden werden COS-Modellsubstanzen mit unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften mithilfe von spezifisch dafür entwickelten Enzymen synthetisiert, die vom Host Prof. Withers bereitgestellt werden. Die Resultate der kinetischen Studien und weiterer Untersuchungen ermöglichen einen Einblick in das bevorzugte Chitosansubstrat von HjCBH in Hinblick auf dessen Struktur. Dadurch können entscheidende Parameter des COS bestehenden COS Produktionsprozesses optimiert werden und somit die Hydrolyseausbeute gezielt verbessert werden. Das Projekt umfasst einen multidisziplinären Forschungsansatz um die beschriebene Fragestellung möglich akkurat zu behandeln. Dieses vielfältige Methodenreportoire wird seine Anwendung in fortlaufenden Studien an der Heiminstitution finden. Im Rahmen der Rückkehrphase werden Cellobiohydrolasen mit ähnlichen strukturellen Eigenschaften selbst hergestellt und mit den gelernten Methoden auf deren Chitosanhydrolyseaktivität getestet. Weiters wird die Rolle der Kohlenhydrat-bindenden Domänen dieser Enzyme auf die Hydrolyseaktivität untersucht, eine Kernkompetenz im Labor von Prof. Gübitz (Heiminstitution). Diese Studie wird entscheidende Parameter der Produktion von COSs mithilfe von chitosan- unspezifischen Enzymen optimieren. Weiters werden die gewonnen Resultate ein Einblick darin geben, warum CBHs der Pilzgattung Trichoderma eine Chitosan hydrolysierende Nebenaktivität entwickelt haben. Dies könnteRückschlüsse auf eventuell zusätzlichebiologische Eigenschaften dieser Enzyme in Pilzen zulassen.

Cellobiohydrolasen (CBHs) sind essenzielle Komponenten des enzymatischen Cocktails von Pilzen, um Zellulose zu verdauen. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass CBH I von Hypocrea jecorina (HjCBH) neben Zellulose auch Chitosan hydrolysieren kann. Die Hydrolyseprodukte von Chitosan, Chito-oligosaccharide (COSs), sind von besonderem Interesse, da diese unter anderem antimikrobielle Eigenschaften aufweisen und zu einer Resistenzsteigerung von Pflanzen führen. Heutzutage basiert die Produktion von COSs auf den Einsatz teurer spezifischer Enzyme, die keine wirtschaftliche Herstellung dieses Naturstoffes ermöglichen. HjCBH wird großindustriell in der Herstellung von Biokraftstoffen verwendet und ist daher in großen Mengen zu erschwinglichen Preisen erhältlich, wodurch der Einsatz dieses Enzym in der Produktion von COSs wirtschaftlich wäre. Dieses Projekt hat sich zur Aufgabe gestellt, den katalytischen Mechanismus der Chitosanhydrolyse durch HjCBH besser zu verstehen, um eine effiziente Implementierung eines enzymatischen Prozesses zur Produktion von COSs zu ermöglichen. Chitosan ist ein heterogenes Polysaccharid, das aus Glucosamin (GlcN) und, zu einem geringeren Anteil, N-Acetyl Glucosamin (GlcNAc) besteht. Bisherige Studien haben gezeigt, dass der Anteil und die Verteilung von GlcNAc im Polysaccharid einen entscheidenden Einfluss auf die Hydrolyseaktivität von HjCBH hat. Mithilfe von Chitosan Modellverbindungen konnten wir in dieser Studie zeigen, dass ein GlcNAc Gehalt von ca. 50%, und eine gleichmäßige Verteilung dieses Monosaccharids in Chitosan, zu einer optimalen Hydrolyserate von HjCBH führen. Zellulose und Chitosan sind strukturell ähnlich und unterscheiden sich nur marginal durch das Vorkommen eines Amins oder einer N-Acetyl Gruppe am Monosaccharid Bausatz von Chitosan, während diese Gruppen durch ein Hydroxid in Zellulose ersetzt sind. Diese geringe Differenz führt allerdings zu beträchtlichen Unterschieden in den Eigenschaften der zwei Polysaccharide. Mit Hilfe von verschiedenen computerunterstützten Simulationen konnten wir zeigen, wie es HjCBH zu Wege bringt, an Chitosan trotz der voluminösen N-Acetyl Gruppen zu binden. Durch das Berechnen von Bindungsenergien konnten wir weiters zeigen, dass HjCBH um die Enzymschnittstelle GlcNAc statt GlcN bevorzugt. Mit den Ergebnissen im Rahmen des Projekts konnten weitere Einblicke den katalytischen Mechanismus von HjCBH in der Hydrolyse von Chitosan gewonnen werden, wodurch die Grundlage für die Implementierung dieses Enzyms für die Herstellung von COSs gelungen ist. Eine gesteigerte Verfügbarkeit von definierten COSs wird sich nachhaltig auf die Erforschung deren bioaktiver Eigenschaften auswirken und weiterführend die Applikation dieses Naturstoffes in unterschiedlichen Bereichen, wie in der Medizin und im Pflanzenschutz, beschleunigen.