Seltene mtDNA Varianten in Geweben und einzelnen Oozyten

Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) sind an einer Vielzahl an Krankheiten beteiligt, wie Typ 2 Diabetes Mellitus, aber auch Krebs und das Altern. Die meisten dieser Krankheiten sind mit heteroplasmischen Stellen in der mtDNA, was die Existenz mehrerer mtDNA Varianten in einer Person bezeichnet, assoziiertet. Wenn der Anteil der krankheitsassoziierten Varianten einen Schwellenwert übersteigt treten Symptome auf. Trotz der ausschließlich mütterlichen Vererbung von mtDNA kann z.B. ein Nachkomme einer gesunden Mutter, aufgrund von Verschiebungen in der Frequenz des heteroplasmischen Allels, Krankheitssymptome zeigen. Während die Weitergabe von Heteroplasmien mit einer Frequenz über 1% an die nächste Generation bereits gut untersucht ist, weiß man noch wenig über welche, die mit geringeren Frequenzen auftreten. Eine Untersuchung dieser seltenen Heteroplasmien, aber auch von mtDNA in einzelnen Oozyten (wodurch mtDNA an die nächste Generation vererbt wird), würde helfen die folgenden Fragen zu beantworten: Wie können neue (möglicherweise pathogene) Mutationen in der Keimbahn entstehen? Wie werden diese an die nächste Generation weitergegeben? Wie kann sich die Frequenz einer heteroplasmischen Variante von einer ursprünglichen Mutation auf ein pathogenes Level erhöhen? Daher werden die Ziele dieses Projektes sein: (1) experimentelle Bedingungen zum Erhalt hochqualitativer mtDNA Sequenzen zu etablieren, (2) hochqualitative mtDNA Sequenzen aus somatischen Mausgeweben und einzelnen Oozyten von Mütter und Nachkommen zu generieren, und (3) die Vererbung von Heteroplasmien zu analysieren und die mtDNA Mutationsrate in der Keimbahn zu bestimmen. Fortgeschrittene Sequenziertechnologien welche eine sehr geringe Fehlerrate aufweisen, gekoppelt mit speziellen Verfahren in der Probenvorbereitung, werden verwendet um hochqualitative mtDNA Sequenzen aus Mausgeweben sowie von einzelnen Oozyten weiblicher Mäuse und deren Nachkommen zu generieren. Dieses detailliertes Wissen über die Entstehung und Vererbung von mtDNA Heteroplasmien ist einerseits wichtig, da derzeit keine effizienten Heilmittel für mtDNA assoziierte Krankheiten erhältlich sind. Zusätzlich gibt es neue Möglichkeiten im Bereich von in vitro Fertilisation (IVF) wie tri-parentale IVF, wobei mtDNA von einem dritten Elternteil verwendet wird um die Vererbung von mtDNA assoziierten Krankheiten zu vermeiden. Die Entwicklung einer Methode zum Erhalt hochqualitativer mtDNA Sequenzen, in Kombination mit der Analyse von Variationen mit geringer Frequenz in Müttern und Nachkommen, wird es erlauben ein umfangreiches Bild von Heteroplasmie-Vererbung zu erhalten. Es wird wichtige Informationen über zugrundeliegende Prozesse liefern welche mtDNA beeinflussen. Obwohl sich dieses Projekt auf die Analyse von Heteroplasmien in der Maus als Modellorganismus konzentriert, können die entwickelten Methoden auch bei anderen Spezies wie dem Menschen angewandt werden.

Mutationen - Änderungen in DNA Sequenzen - erzeugen genetische Variationen welche als Basis für weitere evolutionäre Kräfte wirken, aber auch zahlreiche genetische Krankheiten verursachen können. Mutationen im mitochondrialen Genom (mitochondriale DNA: mtDNA) - Mitochondrien sind die Kraftwerke unserer Zellen - sind an einer Vielzahl an Krankheiten beteiligt, wie Typ 2 Diabetes Mellitus und Krebs, aber auch am Altern. Trotzdem weiß man sehr wenig darüber wie neue Mutationen in mtDNA entstehen. Mit herkömmlichen Sequenzierungsmethoden - welche eine höhere Fehlerrate aufweisen als die Mutationsrate selbst - weiß man meist nicht ob Änderungen in der DNA Sequenz neue Mutationen oder Sequenzierungsfehler darstellen. In dieser Studie habe ich daher eine weiterentwickelte und extrem akkurate DNA-Sequenzierungsmethode - Duplex Sequencing - verwendet, um die gesamte mtDNA in weiblichen Geschlechtszellen (Eizellen - durch welche mtDNA an die nächste Generation weitergegeben wird) und Körperzellen (Gehirn und Skelettmuskel) zu sequenzieren. Wenn man DNA mit einer gedrehten Strickleiter vergleicht, mit zwei parallellaufenden Seilen und Sprossen welche die Seile verbinden, kann man die Leiter in der Mitte der Sprossen teilen, und jede Seite stellt dann einen Strang dar. Während die meisten Sequenzierungsmethoden nur jeweils einen Strang analysieren, berücksichtigt man beim Duplex Sequencing beide Stränge, und vergleicht diese um Fehler zu minimieren. Dadurch konnten wir sicher sein, dass wir tatsächliche neue Mutationen messen. Nachdem für Duplex Sequencing normalerweise eine große Menge an DNA Startmaterial nötig ist mussten wir zuerst das Protokoll optimieren, um mit winzigen DNA Mengen welche in einer Eizelle vorhanden sind arbeiten zu können. Durch die Sequenzierung von Eizellen und Körperzellen von 36 Mäusen aus zwei separaten Stammbäumen konnten wir zeigen, dass, abhängig vom Zelltyp, 10-Monate alte Mütter ca. 2-3x mehr Mutationen aufwiesen wie deren 20-Tage alte Jungen. Dies stellt eine Akkumulation von Mutationen in nur 9 Monaten dar. Mutationsfrequenzen und Muster unterschieden sich zwischen Eizellen und Körperzellen, und zwischen verschiedenen Regionen in der mtDNA, was auf unterschiedliche Mutationsmechanismen hindeutet. Durch die Verwendung von Duplex Sequencing konnten in dieser Studie erstmals die Feinheiten der Keimbahn Mutagenese aufgezeigt werden, wodurch eine beispiellose Auflösung erzielt werden konnte. Die direkte Analyse von Eizellen minimierte den Einfluss weiterer Effekte welche normalerweise in Stammbaumanalysen vorhanden sind. Zusätzlich konnten wichtige Informationen über den Ursprung und die Akkumulation von Mutationen beim Altern gewonnen werden, was auch in Bezug auf das immer spätere Fortpflanzungsalter in Modernen menschlichen Gesellschaften von Bedeutung ist. Des Weiteren eröffnet die für einzelne Zellen Weiterentwickelte Duplex Sequencing Methode neue Möglichkeiten in der Analyse von seltenen Mutationen in weiteren Studien.