Funktionelle Charakterisierung der Klasse II PI3-Kinasen

Lipide sind wichtige Bestandteile biologischer Membranen, welche Zellen und deren Organellen innerhalb der Zelle umgeben. Spezielle Lipide wie Phosphatidylinositole (PI) sind nicht nur Bausteine dieser Membranen, sondern dienen auch als Signalmoleküle und bestimmen die Membranidentität. Dies kontrolliert das Zellwachstum, das Überleben, die Differenzierung und die intrazelluläre Membrandynamik. Je nach Modifikationszustand, wie zum Beispiel Phosphorylierung, können sie ihr Signalpotential verändern und sind als Folge nur an bestimmten Stellen innerhalb der Zelle oder Membranen zu finden. Unter den sieben verschiedenen phosphorylierten Phosphatidylinositolen (PIP), die bei Säugetieren vorkommen, wird Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat [PI(3,4)P2] von Klasse-II-PI3-Kinasen(PI3KC2a-c) hergestellt, wobei deren Funktion am wenigsten verstanden wird. Jüngste Studien aus dem Gastlabor zeigten, dass diese Kinasen den Prozess der Molekülaufnahme in die Zelle (Endozytose) regulieren, aber auch den zellulären Nährstoffstatus reflektieren. Eine Fehlfunktion von PI3KC2-Kinasen kann zu verschiedenen Erkrankungen wie Diabetes und Krebs führen, aber der Mechanismus, wie diese Kinasen ihre Aktivität regulieren, bleibt ungeklärt. Um die Fragen der Regulation und Funktion im Detail klären zu können wird diese Forschungsarbeit an einem erstklassigen Forschungsinstitut in Berlin durchgeführt, welches über hervorragende Techniken und Instrumente verfügt. Insbesondere werde ich auf Reagenzien und experimentelle Verfahren zurückgreifen, die kürzlich vom Host-Labor etabliert wurden, um hohe Mengen an reinem und aktivem PI3KC2 zu produzieren, die für die biochemische und strukturelle Charakterisierung geeignet sind. Die Verfügbarkeit an hohen Mengen löslichem und aktivem PI3KC2 ermöglicht erstmals eine präzise biochemische, strukturell biologische und funktionelle Charakterisierung dieser wichtigen Klasse von Enzymen. Mit der finanziellen Unterstützung des Schrödinger-Stipendiums mache ich es mir zur Aufgabe die Struktur und den Mechanismus der Aktivierung von PI3KC2a und PI3KC2b anhand einer Vielzahl unterschiedlicher molekularbiologischer Ansätzen zu klären. Darüber hinaus erhielt ich in den letzten 8 Jahren umfangreiche Erfahrungen und Schulungen in der Proteinkristallographie, die mir helfen, qualitativ hochwertige Proteinkristalle herzustellen, die geeignet sind, die Struktur von PI3KC2a- und b mit Hilfe von Röntgenbeugungsexperimenten zu lösen. Solche 3D- Strukturen werden zum Verständnis der PI3KC2a/b-Regulation und -Funktion bei der Endozytose und Nährstoffsignalisierung beitragen und damit den Weg für die pharmakologische Manipulation dieser Enzyme ebnen, um neue Strategien für die Behandlung von myotubulärer Myopathie und eventuell Diabetes und Krebs zu entwickeln.

Lipide sind wichtige Bestandteile biologischer Membranen, die entscheidend sind, um die Zelle und ihre intrazellulären Organellen von der Außenwelt zu trennen. Phosphatidylinositol (PI) und seine phosphorylierten Derivate (PIPs) sind spezielle Lipide, die als Signalmoleküle fungieren und die Membranidentität definieren, um unter anderem Zellwachstum, Überleben, Differenzierung, Migration und intrazelluläre Membrandynamik zu steuern. Jede der sieben PIP-Varianten hat spezialisierte Funktionen innerhalb der Zelle, wobei Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat [PI(3,4)P2] am wenigsten verstanden wird. Jüngste wegweisende Studien aus dem Gastlabor haben die PI-3-Kinasen PI3KC2a und b der Klasse II, als wichtige PI(3,4)P2-synthetisierende Enzyme an der Plasmamembran und innerhalb des endolysosomalen Systems identifiziert, um die Aufnahme von Nährstoffen zu regulieren. Trotz ihrer wichtigen zellphysiologischen Funktionen und der Tatsache, dass eine Fehlregulation von PI3KC2a-c mit Diabetes und Krebs in Verbindung gebracht wird, ist der Mechanismus, der die PI3KC2a-c-Aktivität reguliert, noch wenig verstanden. Mit Hilfe des Erwin Schrödinger Stipendiums wollte ich diese wichtige Wissenslücke schließen, indem ich die hervorragenden Möglichkeiten des Gastlabors nutzte, um die molekularen Grundlagen der Klasse-II-PI3K-Funktion zu analysieren. Um den Aktivierungs- und Regulationsmechanismus außerhalb der Zelle (in vitro) zu verstehen, wurden biochemische Untersuchungsverfahren mit rekombinant hergestelltem Protein durchgeführt. Anfangs wurde erfolgreich ein geeignetes Expressions- und Reinigungsprotokoll erstellt, um große Mengen an löslichem und aktivem PI3KC2 herzustellen. Durch die Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher Proteinkonstrukte war ich in der Lage, die Domänen und ihre zugehörigen Aminosäuren zu detektieren, die für die Bindung spezifischer PIPs essentiell sind. Zusätzlich konnte ich PIPs identifizieren, die zwar in der Lage sind die Kinaseaktivität zu steigern, aber kein Substrat phosphorylieren. Schließlich habe ich im Gastlabor Konstrukte entworfen, die für die strukturelle Charakterisierung wie Kristallographie und Cryo-EM geeignet sind. Ebenso konnte ich Kristalle züchten und ein Protokoll erstellen, um erste negative Färbebilder des PI3KC2b aufzunehmen. Zusätzlich wurden solche Konstrukte in den Screening-Experimenten implementiert, um spezifische PI3KC2-Inhibitoren zu finden. Mit der finanziellen Unterstützung des Schrödinger-Stipendiums konnte ich den Weg ebnen, um in naher Zukunft die Struktur und Mechanismen der PI3KC2a und PI3KC2b Aktivierung durch eine Vielzahl unterschiedlicher molekularbiologischer Ansätze aufzuklären. Darüber hinaus konnte ich meine Erfahrung und Ausbildung in Strukturbiologie, Protein- und Lipidbiochemie und Zellbiologie weiter vertiefen. Zusammenfassend bot der Forschungsaufenthalts am FMP-Berlin, mit finanzieller Unterstützung des FWF Erwin Schrödinger Auslandstipendiums, eine einmalige Gelegenheit um alle Fähigkeiten zum Leiten einer eigenen, unabhängige Forschungsgruppe zu erlernen. In Zukunft strebe ich die Habilitation und die Bewerbung auf eine Professur an.