Transkriptionelle Autoregulation Synthetischer Enzymkaskaden

Während der Evolution entwickelten sich effiziente Stoffwechselwege, welche in der Regel aus mehreren Enzymen bestehen, die in Kaskaden angeordnet sind. Natürliche Stoffwechselwege werden streng reguliert, um grundlegende zelluläre Vorgänge wie Wachstum und Reproduktion zu garantieren. Wichtige regulatorische Proteine sind Transkriptionsfaktoren (TFs). Diese binden kleine Moleküle wie Nährstoffe, die in der Umwelt vorkommen, aber auch Metaboliten oder Stoffwechselintermediate, die im Inneren einer Zelle gebildet werden. Die Bindung dieser Moleküle befähigt TFs dazu, spezifische Stellen im Genom zu erkennen, um die Produktion von Enzymen, die Nährstoffe verstoffwechseln und Metaboliten umwandeln und weiterverarbeiten, zu induzieren, zu adaptieren und zu koordinieren. Ziel dieses Projekts ist die Implementierung synthetischer Enzymkaskaden in Escherichia coli, einem der bedeutendsten Mikroorganismen in der Biotechnologie, und deren Regulation durch maßgeschneiderte TFs. Wie in natürlichen Stoffwechselwegen, sollen diese TFs Substrate, Intermediate und potentielle Nebenprodukte artifizieller Stoffwechselwege binden, um die Produktion der beteiligten Enzyme zu induzieren und zu koordinieren. Die Konzepttauglichkeit wird an einem künstlichen Stoffwechselweg demonstriert, der aus primären Alkoholsubstraten über Aldehydintermediate Phenyacetylcarbinole herstellt. Phenylacetylcarbinole sind wichtige Precursor für Pharmazeutika, die breite Anwendung bei der Behandlung von niedrigem Blutdruck, Übergewicht oder chronischen Atemwegserkrankungen finden. Für die Anpassung der Bindungsspezifitäten von TFs werden komplementäre Strategien verfolgt: (1) Bestimmung der Promiskuität bereits bekannter TFs für nicht-natürliche, strukturell verwandter Moleküle durch Bindungsassays. (2) Anpassung/Änderung von Bindungsspezifitäten durch Protein Engineering. Protein Engineering wird für gewöhnlich an Enzymen und nicht an TFs durchgeführt. (3) Identifizierung neuer TFs mit Hilfe großer Bibliotheken aus solute-binding proteins (SBPs). SBPs ermöglichen den Transport von Nährstoffe und anderer kleiner, löslicher Moleküle in die Zelle. Dazu binden SBPs diese Substanzen, ähnlich wie TFs. Die Innovation dieser Strategie liegt in der Verknüpfung zwischen der Bindung Kaskaden-relevanter Moleküle durch SBPs und der Kodierung und Lokalisierung von SBPs in mikrobiellen Genomen. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden lässt sich die genetische Nachbarschaft der SBPs genauer studieren, um neue TFs, die spezifisch Kaskaden-relevante Moleküle binden, zu entdecken. Dies ist möglich, da SBPs, die Enzyme des entsprechenden Stoffwechselweges und die regulatorischen TFs in der Regel zusammen in mikrobiellen Genomen zu finden sind. Um die Implementierung maßgeschneideter TFs für die zeitllich abgestimmte Produktion aller Kaskadenenzyme in ausreichenden Mengen zu erreichen und die gewünschten Phenyacetylcarbinole zu synthetisieren, ist die Kombination von Methoden aus synthetischer Biologie, Ganzzellbiokatalyse, Protein Engineering und Bioinformatik notwendig. Der interdisziplinäre Charakter dieses Projekts soll das neue, auf beliebige Enzymkaskaden übertragbare, Konzept der transkriptionellen Auto-Regulation ermöglichen, um zukünftig nicht nur ökologischere Alternativen zu traditionellen Synthesewegen in der chemischen und pharmazeutischen Industrie zu schaffen, sondern um künstliche Stoffwechselwege, nach dem Vorbild natürliche Stoffwechselwege, zu regulieren und optimieren.