Leben und Sterben mit reaktiven Sauerstoffspezies

Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen weltweit die Haupttodesursache dar, die vor allem durch Herzinfarkt, Schlaganfall oder Herzschwäche verursacht wird. Diese Krankheiten des Herzens und der Blutgefäße sind mit einem Ungleichgewicht von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen verbunden. Endothelzellen bilden die innerste Wandschicht der Blutgefäße und sind direkt biochemischen und biomechanischen Einflüssen im Blut ausgesetzt. Diese Reize regulieren sowohl die gesunde als auch die schädliche Bildung von ROS sowie die Gefäßerweiterung und - durchlässigkeit. Das am häufigsten vorkommende intrazelluläre ROS ist Wasserstoffperoxid (H2O2). Neben H2O2 sind auch Calciumionen (Ca2+) und Stickstoffmonoxid (NO) wichtige Vermittler in Endothelzellen, die massgeblich für die Einstellung der Gefäßweite verantwortlich sind. Im vorliegenden Projekt wird das Zusammenspiel dieser drei Botenstoffe und deren Auswirkungen auf das Herzkreislaufsystem untersucht. Mit Hilfe von leuchtenden Sensoren können hierfür H2O2, Ca2+ und NO an einem Fluoreszenzmikroskop in unterschiedlichen Orten von Endothelzellen gemessen und die Reaktionen auf bestimmte Reize genau beobachtet werden. Darüber hinaus ermöglicht es eine neu entwickelte Methode, H2O2 innerhalb dieser Zellorte zu bilden. Dieser Ansatz nutzt ein Enyzm aus der Hefe, die D-Aminosäureoxidase (DAAO), welche D-Aminosäuren in H2O2 umwandelt. Dadurch kann der Einfluss von H2O2 auf NO und Ca 2+ innerhalb von Zellen nachgeahmt und das Zusammenspiel beobachtet werden. Parallel zu diesen zellulären Messungen wird dieser Ansatz auch in einem lebenden Modell in Mäusen verfolgt, die DAAO in ihre Erbinformation eingebaut haben. Vor kurzem wurde im Labor meines Gastprofessors Dr. Michel eine derartige transgene Maus entwickelt. Füttert man diese Mäuse mit D-Aminosäuren wird in ihren Zellen H2O2 gebildet. Durch die Entwicklung eines weiteren Mausmodells, welches DAAO ausschliesslich in ihren Endothelzellen hat, wird der Einfluss von H2O2-vermittelten Wirkungen auf die Blutgefäße untersucht. Mit Hilfe dieses Lebendmodells können so chronischer Stress durch ROS oder H2O2-vermittelte Gefäßerweiterungen studiert werden. In diesem Projekt werden modernste bildgebende Verfahren, leistungsstarke Biosensoren und völlig neuartige chemogenetische Ansätze verwendet, um die Rolle von H2O2 im Gefäßsystem zu untersuchen. Die vorgeschlagenen Studien verwenden eine Kombination von In -vitro-, In-vivo- und Ex-vivo-Ansätzen, die meine jahrelange Erfahrung in den Gebieten der Zellbildgebung und Biophysik von Endothelzellen auf Lebendmodelle ausweiten werden. Das Projekt wird unter meiner Leitung mit Hilfe meines Gastprofessors Dr. Thomas Michel und in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Wolfgang Graier am Brigham and Womens Hospital in Boston durchgeführt.

Oxidativer Stress ist ein häufiger Risikofaktor für kardiovaskuläre und neurologische Erkrankungen. Wasserstoffperoxid (H2O2) ist die stabilste reaktive Sauerstoffspezies, die in geringen Konzentrationen für physiologische Prozesse benötigt wird, in hohen Konzentrationen jedoch zu oxidativem Stress führt. Während meines Aufenthalts im Labor von Dr. Thomas Michel am Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, haben wir in vitro und in vivo Modelle entwickelt, um die Wirkung von (patho)physiologischem H2O2 aufzuklären: Wir führten Echtzeit-Messungen in humanen Endothelzellen aus Nabelschnurvene (HUVEC) durch. Mit Hilfe des neuartigen ultrasensitiven H2O2-Biosensors HyPer7.2 detektierten wir stabile H2O2-Signale als Reaktion auf Histamin, einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Agonisten, als auch auf den Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Agonisten VEGF. NADPH-Oxidasen (Nox) Isoformen sind potenzielle Quellen der zellulären H2O2 Erzeugung. Mithilfe von siRNA-vermittelten Knockdown-Experimenten fanden wir heraus, dass die rezeptorvermittelte H2O2-Signalgebung unterschiedlich von den verschiedenen NOX-Isoformen 2 und 4 sowie von der kleinen GTPase Rac1, einem Hauptbestandteil des NOX2 Komplexes, abhängt. Wir haben dieses Modell verwendet, um die antioxidativen Wirkungen von Statinen zu untersuchen, die nicht genau bekannt sind. Statine sind HMG-CoA-Inhibitoren, die neben der Senkung des LDL-Cholesterinspiegels auch die Synthese von Isoprenoid-Lipiden blockieren, welche für die posttranslationale Modifikation von Signalproteinen, einschließlich Rac1, erforderlich sind. Wir haben beobachtet, dass die Simvastatin-Behandlung die Rac1-Translokation von der Zellmembran zum Zellkern fördert, begleitet von einem Verlust der endothelialen H2O2 Antwort auf beide Agonisten, Histamin und VEGF. Diese Simvastatin-Wirkungen waren durch Zellbehandlung mit Mevalonsäure, dem enzymatischen Produkt der HMG-CoA-Reduktase, reversibel. Unsere belegen Studien, dass intrazelluläre H2O2 Signale durch die Stimulierung mit Histamin oder VEGF unterschiedlich die beiden Nox-Isoformen 2 und 4 aktivieren und von Rac1 abhängig sind. Wir haben auch neue gewebespezifische transgene Mausmodelle für oxidativen Stress unter Verwendung des aus Hefe stammenden Enzyms D-Aminosäureoxidase (DAAO) entwickelt, das H2O2 in Gegenwart von D-Aminosäuren erzeugt. Unter Verwendung des mutmaßlich Endothel-spezifischen Cdh5-Promotors führten wir DAAO in Maus-Endothelzellen ein und erwarteten einen Gefäßdefekt nach Induktion von oxidativem Stress durch Fütterung der Mäuse mit D-Alanin. Diese Mäuse entwickelten jedoch 2 Tage nach Fütterung mit D-Alanin im Trinkwasser schnell einen unerwarteten ataktischen Phänotyp; Kontrollmäuse waren völlig unbeeinflusst. Autopsien der transgenen Mäuse zeigten eine selektive Neurodegeneration im Rückenmark, die nur die dorsale Sinnessäule betraf. Die immunhistochemische Analyse zeigte zusätzlich zum Endothel eine robuste Transgenexpression in Spinalganglien. Wichtig ist, dass die Echokardiographie chronisch behandelter Mäuse das Vorhandensein einer hypertrophen Kardiomyopathie feststellt. Zusammenfassend ähnelt diese Pathologie dem Phänotyp von Patienten mit Friedreich-Ataxie, der häufigsten Form der erblichen Ataxie beim Menschen, die durch mitochondriale Dysfunktion und oxidativen Stress verursacht wird. Diese neue transgene Mauslinie stellt ein neues und potenziell wichtiges Mausmodell für die Friedreich-Ataxie dar und bestätigt die Bedeutung von oxidativem Stress bei der Neurodegeneration.