Enzymatische Umwandlung von A und B zu Typ O Blut

Bluttransfusionen zählen zu den häufigsten Maßnahmen in der Klinik, wobei rote Blutzellen in einer Größenordnung von 85 Millionen Einheiten pro Jahr weltweit verabreicht werden. Essentiell ist hierbei die korrekte Zuordnung der A, B, AB und 0 Blutgruppenantigene, die auf unterschiedliche Zuckersequenzen an der Oberfläche der Blutkörperchen zurückzuführen sind. Im Plasma von Individuen mit Blutgruppe A werden Antikörper gegen Blutgruppe B gebildet und vice versa. Eine Transfusion von Blut der Blutgruppe B in Patienten der Blutgruppe A würde daher zu einer massiven Aktivierung des Immunsystems mit nachfolgender Zerstörung der Blutzellen bis hin zum Tod führen. Die Zelloberfläche der Blutgruppe 0 hingegen, wo der endständige Zucker fehlt, hat keine Antigeneigenschaften, und dieses Blut kann daher für Transfusionen an alle Personen verwendet werden. Ein Überschuss von Blut der Gruppe 0 in den Blutbanken ist daher notwendig für Notfälle, wo die Blutgruppe nicht bekannt ist, oder um einen Mangel an Blut der Gruppen A oder B zu kompensieren. Die Umwandlung von beiden Gruppen A und B in die Blutgruppe 0 hat daher in den letzten Jahren großes wissenschaftliches Interesse gefunden. Dabei werden die A und B Antigene an der Oberfläche der roten Blutkörperchen durch enzymatische Spaltung in die Blutgruppe 0 umgewandelt. Trotz erster Erfolge in der Umwandlung der Blutgruppe B in die Blutgruppe 0, ist die schwierigere Reaktion an der Blutgruppe A auf Grund der geringen Enzymaktivitäten noch nicht zufriedenstellend gelöst. Kürzlich ist es der Gruppe von Stephen Withers an der University of British Columbia in Vancouver gelungen mit einem 2-fachen Enzymsystem aus humanen Darmbakterien die Umwandlung der Gruppe A in die Gruppe 0 zu realisieren. Die Methodik beruht auf isolierten Genomen der Bakterien in menschlichen Faeces, wobei Tausende Testreaktionen von Enzymen mit fluorogenen Modellverbindungen der A und B Blutgruppen durchgeführt wurden. Diese Substrate enthalten lediglich die spezifischen endständigen Zucker und produzieren im Fall der erfolgreichen enzymatischen Spaltung ein Fluoreszenzsignal. Obwohl dieser Ansatz erfolgreich für die Identifizierung von potenten Enzymen eingesetzt wurde, ist es wahrscheinlich, dass es weitere Enzyme gibt, die für die ganze Sequenz der A und B Antigene geeignet sind. Da für die zahlreichen Tests die Verfügbarkeit der synthetischen komplexen Substrate begrenzt ist, soll die Methode für kleinste Volumina adaptiert werden. Die Ziele des Projekts liegen daher in der Miniaturisierung des Reaktionssystems mittels Mikrofluid-Technologien. Dabei kommen Wasser-in-Öl Tröpfchen in der Größe von Piko- bis Femtolitern zum Einsatz, wodurch bis zu 100 Millionen Enzyme pro Tag getestet werden können. Zusätzlich werden weitere Enzymquellen untersucht werden, um effiziente Enzyme für die Umwandlung der A und B Blutgruppen zu finden und damit eine universelle Versorgung mit Blutgruppe 0 für Bluttransfusionen in der Zukunft zu ermöglichen.

Blutgruppen sind durch Antigene auf der Oberfläche der Blutkörperchen definiert. Die A,B und O definierenden Antigene basieren auf spezifischen Zuckerketten. Im Blutplasma von Personen mit Blutgruppe A koennen Antikörper gegen Blutgruppe B Antigene gefunden werden und umgekehrt. Eine Transfusion von Blut der Blutgruppe B in Patienten der Blutgruppe A würde daher zu einer sofortigen Aktivierung des Immunsystems fuehren, mit katrastophalen Folgen. Eine Ausnahme ist die Blutgruppe 0, deren Zelloberflächeantigene haben, im vereinfachten Sinne, keine Antigeneigenschaften, da ihnen ein spezifischer Zucker fehlt. Daher kann man O Blut als Spenderblut für Transfusionen an alle Personen verwendet, unabhaengig von der Empfaenger Blutgruppe. Diese Eigenschaft macht Blut der Blutgruppe O besonders wertvoll, vorallem in Notfallsituationen. Eine Moeglichkeit zu finden, Blut der Gruppen A und B in O umzuwandeln ist dehalb sehr interessant fuer die Wissenschaft. Im Mittelpunkt steht hier ein Verfahren, womit die A und B Antigene (Zuckerketten) auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen durch enzymatische Spaltung in die der Blutgruppe 0 umgewandelt werden. Forschern an der UBC, unter Leitung von Stephen Withers, ist es vor Kurzem gelungen Blutkoerperchen der Gruppe A in Gruppe O umzuwandeln. Dies war durch Einsatz von zwei Enzymen moeglich. Die benoetigten Enzyme wurden in humanen Darmbakterien entdeckt, durch ein Verfahren genannt "metagenomic screening". Hierfuer wurde zuerst das Erbguts der Bakterien aus menschlichem Kot isoliert. Um die isolierten Gene auf Aktivitaet zu testen wurden tausende von Testreaktion mit zwei fluorogenen Modellsubstraten, welche den A und B Blutgruppen nachempfunden sind, durchgefuert. Die Modelsubstrate enthalten die spezifischen endständigen Zucker der A und B Antigene, nicht das vollstaendige Antigen, und im Fall der erfolgreichen enzymatischen Spaltung wird ein Fluoreszenzsignal messbar. Obwohl dieser Ansatz erfolgreich für die Identifizierung des ersten Enzymesets war, ist es sehr wahrscheinlich, dass weitere Enzyme mit moeglicherweise besseren Eigenschaften existieren. Idealerweise wuerde man den Aktivitaetstest wiederholen, aber Substrate verwenden, die dem ganzen A und B Antigen entsprechen. Diese Substrate sind aber extrem schwierig herzustellen und daher besonders kostbar. Um zu Gewaehrleisten, dass genug Substrate fuer die Tests zur Verfuegung steht, sollte eine Testsystem entwickelt werden die mit minimalen Volume auskommt. Daher habe ich ein robustes, Ultra-Hochdurchsatz Testsystem entwickelt. Dieses basiert auf einem Wasser-in-Öl Gemisch welches Mikro-Troepefchen erzeugen kann (Microfluidic). Diese Troepfchen funktionieren als miniaturisierte Reaktionssysteme, mit einer Größe von Piko- bis Femtoliter. Hierdurch koennen bis zu 9x106 Enzyme pro Stunde auf B-Antigen-spaltende Aktivitaet getestet werden und es wird nur ein Milligramm Substrat benoetigt. Das entwickelte System ermoeglichte mir die erfolgreiche Identifizierung von Enzymen die die Umwandlung von B- in O- Blutzellen ermoeglichen koennten. Vorläufige Testresultate fuer den Einsatz dieser B-spaltenden Enzyme fuer die Generierung von O-Blut sind vielverspechend. Diese Enzyme koennten ein weiter Schritt in die richtige Richtung fuer die Herstellung von mehr O Blut für Transfusionen sein.