ultra-sensitiver und hochauflösender Microarray Scanner

Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung eines kompakten fluoreszenz-basierten Microarray Scanners mit Einzelmolekülsensitivität. Das System basiert auf einer neuartigen Technologie, die zum ersten Mal Hoch- Durchsatz Scannen von großen Flächen mit Einzelmolekülempfindlichkeit und beugungslimitierter Auflösung ermöglicht. Mit dieser hohen Empfindlichkeit und einem gesamten dynamischen Bereich von acht Größenordnungen wird dieses System den momentan erhältlichen Auslesegeräten deutlich überlegen sein. Damit wird es bisher nicht zugängliche Information in der Microarray Analyse erstmals zugänglich machen. Microarrays ermöglichen die Analyse von Gen-Expression, DNA Sequenzvariationen, Proteinexpressionslevels, Zellen und anderen biologischen und chemischen Molekülen in einem massiv parallelen Prozeß. Die nunmehrige Verfügbarkeit von kommerziellen RNA Expressionsplattformen und mehr als 5000 Veröffentlichungen im Bereich Microarrays verdeutlichen die schnellen Fortschritte dieser Technologie in Grundlagen- bzw. angewandter Forschung. Als Konsequenz dieses enormen wissenschaftlichen Potentials wird für den globalen Markt ein sehr schnelles Wachstum vorhergesagt (DNA-Microarrays: von 596 Millionen US$ 2003 auf 937 Millionen US $ 2010, Protein Microarrays: von 122 Millionen US$ in 2002 auf mehr als 500 Millionen in 2008). Das Potential dieser Technik steht demnach außer Frage. Nichtsdestotrotz gibt es immer noch große Einschränkungen. Im Fall der DNA Microarrays verhindern fehleranfällige und zeitraubende Amplifizierungsmethoden schnelle und verläßliche Ergebnisse, im speziellen, wenn geringe Probenmengen vorhanden sind. Im Fall von Protein Microarrays, ist es durch das vollständige Fehlen einer zu Polymerase Ketten Reaktion adäquaten Technik überhaupt nicht möglich, Ergebnisse aus kleinen Probenmengen zu erhalten. Mit der Entwicklung eines kompakten ultra-sensitiven Scanners in diesem Projekt, eröffnen wir die Möglichkeit, ohne Amplifizierungsmethoden verläßliche Ergebnisse aus Microarrays zu generieren. Das System wird die Detektion einzelner hybridisierter Biomoleküle innerhalb von Microarray Spots erlauben bei gleichzeitiger genauer Quantifizierbarkeit von bis zu 108 gebundenen Molekülen. Durch die Erweiterung des dynamischen Bereichs um 5 Größenordnungen im Vergleich zu momentan erhältlichen Microarray Scannern, wird dieses System neue Perspektiven in der biomedizinischen Forschung und Diagnostik eröffnen.

In diesem Projekt wurde eine Analyse-Plattform entwickelt, die einerseits die funktionelle Untersuchung einzelner Zellen erlaubt und mit welcher andererseits die Zusammensetzung der zuvor charakterisierten Zellen erforscht werden kann. Die damit möglich Korrelation von Funktion und Zusammensetzung der untersuchten Zellen ist insbesondere bei der Erforschung von heterogenen Zellpopulationen interessant. Heterogenitäten innerhalb von Zellpopulationen sind zum Beispiel aus der Krebsforschung bekannt wo Tumor-Gewebe durch Chemotherapie gut bekämpft werden kann, aber eine kleine Anzahl der Krebszellen - die Krebs-Stammzellen - dabei nicht abgetötet wird. Diese Zellen können dann einen erneuten Ausbruch der Krebserkrankung verursachen. Die durch die Einzelzellanalyse bestimmbaren Eigenschaften der Krebs-Stammzellen können genutzt werden, um geeignete Therapien zu entwickeln. Die Analyse-Plattform basiert auf einem sogenannten Lab-on-a-Chip (LOC) System, welches ein miniaturisiertes Labor darstellt, in dem Probenvolumina von im Nanoliter-Bereich prozessiert werden können. Das System erlaubt das gezielte Einfangen von einzelnen bis 100 Zellen, welche dann mittels optischer Mikroskopie untersucht werden können. Um den Inhalt der Zellen analysieren zu können, werden die Zellen in 0.5 Nanoliter kleinen Reaktionskammern aufgelöst und die Ziel-Moleküle spezifisch mit einem Farbstoffmolekül markiert. Basierend auf Mikroarray Technologie wird dann im Zellinhalt nach bestimmten Ziel-Molekülen gesucht. Durch die geringe Verdünnung im LOC und die Verwendung der Einzelmolekülfluoreszenz-Mikroskopie als Auslesemethode wird sichergestellt, dass alle in der Probe enthaltenen Moleküle detektiert werden können. Die Quantifizierung erfolgt dabei durch Zählen der Moleküle und ist somit nicht von der Markierungseffizienz abhängig. Durch die Bestimmung spektroskopischer Parameter mittels Einzelmolekülfluoreszenz Mikroskopie können außerdem unspezifische Signale erkannt und von der Auswertung ausgeschlossen werden. Die Funktion der entwickelten Analyse-Plattform wurde an einem Modellsystem validiert. Unmarkierte synthetische DNA konnten bis zu einer Konzentration von weniger als 100 Femtomolar nachgewiesen werden; bei dieser Konzentration sind nur noch circa 2100 Ziel-Moleküle in der Probe vorhanden. Durch diese hohe Sensitivität kann die Analyse-Plattform zur Untersuchung von 10 Zellen, in bestimmten Fällen können sogar Einzelzellen, verwendet werden.